紫外可见光谱学:原理、优点、局限性及应用

紫外-可见(UV-Vis)光谱学是一种广泛应用于许多科学领域的技术，从细菌培养从药品鉴定、核酸纯度检查和定量，到饮料行业的质量控制和化学研究。本文将介绍UV-Vis光谱学是如何工作的，如何分析输出数据，该技术的优点和局限性以及它的一些应用。

UV- vis光谱学是一种分析技术，用于测量被样品吸收或通过样品传输的UV或可见光的离散波长的量，与参考样品或空白样品进行比较。这种性质受样品组成的影响，可能提供关于样品中有什么和浓度的信息。由于这种光谱学技术依赖于光的使用，让我们首先考虑光的性质。

光有一定的能量，它与波长成反比。因此，波长较短的光携带更多的能量，波长较长的光携带较少的能量。将物质中的电子提升到更高的能态需要特定的能量，我们可以将其检测为吸收。一种物质中不同成键环境中的电子需要不同的特定能量来将电子提升到更高的能态。这就是为什么不同物质对不同波长的光的吸收。人类能够看到可见光的光谱，从大约380纳米(我们看到的紫色)到780纳米(我们看到的红色)。¹紫外光的波长比可见光短，约为100纳米。因此，光可以用波长来描述，这在UV-Vis光谱学中很有用，可以通过定位最大吸光度对应的特定波长来分析或识别不同的物质(参见UV-Vis光谱学的应用部分)。

紫外-可见分光光度计是如何工作的?

虽然UV-Vis分光光度计有许多变体，为了更好地了解UV-Vis分光光度计的工作原理，让我们考虑图1所示的主要组件。

图1: 紫外-可见分光光度计主要部件的简化示意图。来源:贾斯汀·汤姆博士。

光源

作为一种基于光的技术，能够在宽波长范围内发射光的稳定光源是必不可少的。单氙气灯通常用作高强度光源的紫外和可见光范围。然而，与钨丝灯和卤素灯相比，氙气灯成本较高，稳定性较差。

对于使用两盏灯的仪器，通常使用钨丝灯或卤素灯来显示可见光，²而氘灯是常见的紫外线光源。²由于需要两个不同的光源来扫描紫外和可见光波长，仪器中的光源必须在测量过程中切换。在实践中，这种转换通常发生在300到350 nm之间的扫描过程中，此时两个光源发出的光相似，转换可以更顺利地进行。

波长选择

在下一步中，必须从光源发出的宽波长中选择适合于检测样品类型和分析物的特定波长的光进行样品检查。可用的方法包括:

• 单色仪单色仪将光分离成一个狭窄的波长带。它通常是基于衍射光栅，可以旋转来选择入射和反射角度，以选择所需的光波长。^1，2衍射光栅的沟槽频率通常用每毫米的沟槽数来测量。沟槽频率越高，光学分辨率越好，但可用波长范围越窄。沟槽频率越低，可用波长范围越大，但光学分辨率越差。300到2000凹槽每毫米可用于UV-Vis光谱目的，但最低1200凹槽每毫米是典型的。光谱测量的质量对衍射光栅和光学装置中的物理缺陷很敏感。因此，直纹衍射光栅往往比闪耀全息衍射光栅有更多的缺陷。^3.闪耀全息衍射光栅往往提供明显更好的质量测量。^3.
  
• 吸收过滤器-吸收滤光片通常由彩色玻璃或塑料制成，用来吸收特定波长的光。²
  
• 干涉滤光器-也称为二向色滤波器，这些常用的滤波器由许多层介电材料构成，其中薄层材料之间发生干涉。这些滤波器可以用来消除破坏性干扰的不良波长，从而作为波长选择器。^1，2
  
• 截止滤光片-截止滤光片允许一定波长以下(短通)或以上(长通)的光通过。这些通常使用干扰滤波器实现。
  
• 带通滤波器-带通滤波器允许一段波长通过，可以通过将短通和长通滤波器组合在一起来实现。

由于单色仪的多功能性，最常用于此过程。然而，滤光片经常与单色仪一起使用，以缩小进一步选择的光的波长，以进行更精确的测量，并提高信噪比。

样品分析

无论分光光度计中使用哪种波长选择器，光都会穿过样品。对于所有分析，测量参考样品(通常称为“空白样品”)，如装满用于制备样品的类似溶剂的比色皿，是必要的。如果使用含有样品的缓冲水溶液进行测量，则使用不含感兴趣物质的缓冲水溶液作为参比。检查细菌培养时，以无菌培养基为参考。仪器随后自动使用参考样品信号来帮助获得被分析物的真实吸光度值。

了解紫外-可见光谱实验中使用的材料和条件是很重要的。例如，大多数塑料试管不适用于紫外线吸收研究，因为塑料通常会吸收紫外线。玻璃可以作为过滤器，通常吸收大部分UVC (100 - 280nm)²和UVB (280 - 315 nm)²但允许一些UVA (315 - 400 nm)²通过:通过因此，紫外检测需要石英样品夹，因为石英对大多数紫外线都是透明的。空气也可以被认为是一个过滤器，因为波长小于200纳米的光会被空气中的氧分子吸收。波长小于200nm的测量需要一种特殊且更昂贵的装置，通常涉及充满纯氩气的光学系统。无试管系统也可用于分析非常小的样本量，例如DNA或RNA分析。

检测

当光穿过样品后，用探测器将光转换成可读的电子信号。一般来说，探测器是基于光电涂层或半导体。

一个光电涂层当暴露在光线下时，喷射出带负电荷的电子。当电子被抛出时，就会产生与光强成正比的电流。光电倍增管(PMT)⁴是紫外-可见光谱学中最常用的探测器之一。^2，5PMT是基于光电效应，最初在暴露于光时弹出电子，随后依次增加弹出电子以产生更大的电流。⁴PMT探测器特别适用于探测极低水平的光。

当半导体都暴露在光线下，有一股与光强成正比的电流可以通过。更具体地说，是光电二极管⁶和电荷耦合器件(ccd)⁷是两种最常见的基于半导体技术的探测器。^2，5

当使用的探测器产生电流后，信号就会被识别并输出到计算机或屏幕上。图2和3显示了一些简化的UV-Vis分光光度计布置示例示意图。

图2: 基于比色管的紫外-可见光谱系统示意图。

图3: 无试管UV-Vis光谱系统示意图。⁸

紫外-可见光谱分析，吸收光谱和吸光度单元

UV-Vis光谱学信息可以表现为吸光度、光密度或透射率随波长变化的曲线。然而，这些信息通常以垂直吸光度图的形式呈现y水平轴和波长x轴。这个图通常被称为吸收光谱;图4显示了一个例子。

图4: 从紫外-可见分光光度计获取的吸收光谱示例。检测的样本是溶解在中性pH磷酸盐缓冲液中的过期血红蛋白。来源:贾斯汀·汤姆博士。

基于本文前一节中回顾的UV - Vis分光光度计仪器，光的强度可以合理地预期与样品吸收的光量定量相关。

吸光度(一个)等于光通过样品前的强度分数的对数(我_o)除以光透过样品后的强度(我)．这个分数我除以我_o也称为透过率(T)，表示有多少光通过了样品。然而，通常应用比尔-兰伯特定律来获得样品的浓度(c)测量吸光度后(一个)时，摩尔吸收率(ε)和路径长度(l)是已知的。通常情况下,ε的单位是L mol^{- 1}厘米^{- 1}，l单位是cm，和c的单位是mol L^{- 1}．因此，一个没有单位。

有时AU被用来表示任意单位或吸光度单位，但强烈不鼓励这样做。

如果使用一组含有相同物质的测量标准溶液存在线性关系，那么比尔-兰伯特定律对于获得一种物质的浓度特别有用。方程1显示了吸光度、比尔-兰伯特定律、仪器中测量的光强度和透射率之间的数学关系。^5，9

方程1: 表示吸光度之间关系的一组方程一个、比尔-兰伯特定律、仪器测得的光强、透光率。

术语光密度(OD)有时不正确地与吸光度互换使用。外径和吸光度都测量光学元件中损失的光强量，但外径考虑了光散射造成的损失，而吸光度则不考虑。如果在测量中存在很少的光散射，那么OD可以直接用吸光度近似，并且可以使用比尔-兰伯特定律。

在测量过程中了解实验条件是很重要的。为1厘米路径长度设计的试管是标准的，也是最常见的。有时，可用于检查的样品很少，需要较短的路径长度，如1毫米。当需要定量时，吸光度值应保持在1以下，在仪器的动态范围内。这是因为吸光度为1意味着样品吸收了90%的入射光，或等价地表示为10%的入射光通过样品传输。由于到达探测器的光很少，一些UV - Vis分光光度计不够灵敏，无法可靠地量化少量的光。解决这个问题的两种简单方法是稀释样本或减小路径长度。

如上所述，使用“空白”参考溶液记录基线光谱是必不可少的。如果仪器在各方面都是绝对完美的，那么对每一个被检测波长的基线吸光度都将为零。然而，在实际情况下，基线光谱通常会有一些非常小的正和负吸光度值。为了最佳实践，软件通常自动从每个波长的样品吸光度值中减去这些小的吸光度值，以获得真实的吸光度值。¹

根据分析的目的，可能需要建立校准曲线。建立一个校准曲线需要一些数据分析和额外的工作，但它是非常有用的，以确定一个特定物质的浓度在样品中基于吸光度测量。然而，在许多情况下，不需要校准曲线，包括用于细菌培养的OD测量，用于评估核酸纯度或识别某些药物的特定波长的吸光度比。

在紫外-可见光谱学中，选择目标物质最大吸光度对应的波长进行分析。这种选择确保了最大的灵敏度，因为在一定的分析物浓度下获得了最大的响应。¹图5提供了Food Green 3的紫外可见吸收光谱示例和使用标准溶液的相应校准曲线。注意，Food Green 3染料中存在两个最大吸光度峰，435 nm处的最大吸光度峰较小，619 nm处的最大吸光度峰更强烈。为了在计算未知浓度的Food Green 3时获得最大灵敏度，在619 nm处使用最大吸光度峰进行分析。在已知浓度范围内制备标准溶液，稀释原液，测量吸光度，然后在吸光度与浓度的图表上绘制这些数据，以建立浓度和吸光度之间的数值关系。利用最小二乘线性回归方程建立了校正曲线。数据点越接近直线，拟合效果越好。直线方程中的y截距设为零，表示没有染料存在时没有吸光度。用图5所示的方程，根据测得的吸光度(变量y)，计算未知样品中食品绿3的浓度(变量x)。

图5: 左图显示了从样品中提取的食品绿3的紫外-可见光谱。采用最小二乘线性回归方程，从食品绿3的标准稀释溶液中得到右图所示的校准曲线。来源:贾斯汀·汤姆博士。

对于数据分析，吸光度与浓度的关系图可以表明系统在构建校准曲线时的敏感性。当使用线性最小二乘回归方程时，从最佳拟合线开始的斜率表示灵敏度。斜率越陡，灵敏度越高。灵敏度是区分样品浓度中微小差异的能力。根据比尔-兰伯特定律，灵敏度可以用摩尔吸光度部分表示ε．知道了ε事先的值(如果有的话)可以帮助确定所需样品的浓度，特别是在样品有限或昂贵的情况下。

为了可靠性和最佳实践，应重复进行UV - Vis光谱实验和读数。在重复检查样品时，通常至少进行三次重复试验，但在某些工作领域需要更多的重复试验。一个计算量，如未知样品的浓度，通常报告为带有标准偏差的平均值。可重复的结果对于确保精确、高质量的测量至关重要。标准偏差、相对标准偏差或变异系数有助于确定系统和测量的精度。偏差或变化越小，精度和可靠性越高。

紫外-可见光谱学的优点和局限性

没有一种技术是完美的，紫外-可见光谱学也不例外。然而，该技术确实有以下列出的几个主要优点，使其受到欢迎。

• 技巧是非破坏性的，允许样品重复使用或进行进一步的处理或分析。
• 可以进行测量很快，可以轻松集成到实验协议中。
• 仪器使用方便使用前只需进行少量的用户培训。
• 数据分析通常需要最小的处理，这同样意味着不需要用户培训。
• 仪器通常是便宜的获取和操作，使其可供许多实验室使用。

尽管这种技术的优势似乎是压倒性的，但也有一定的弱点:

• 杂散光-在实际仪器中，波长选择器并不完美，光源仍有可能从较宽波长范围发射少量光，¹可能导致严重的测量误差。⁹杂散光也可能来自环境或仪器中安装松散的隔室。¹
  
• 光散射-光散射是通常由液体样品中的悬浮固体引起，这可能会造成严重的测量误差。在比色皿或样品中气泡的存在会使光散射，导致不可复制的结果。
  
• 来自多种吸收物质的干扰例如，一个样品可能含有多种类型的绿色色素叶绿素。在同一样品中，不同的叶绿素会有重叠的光谱。为了进行正确的定量分析，每一种化学物质都应该从样品中分离出来并单独检查。
  
• 几何方面的考虑-仪器的任何一个部件，特别是装样品的比色皿的位置不对，可能会产生不可重复和不准确的结果。因此，重要的是，仪器中的每个组件都要以相同的方向对准，并在每次测量时放置在相同的位置。因此，一般建议进行一些基本的用户培训，以避免误用。

紫外-可见光谱的应用

UV - Vis已被应用于许多用途和情况，包括但不限于:

DNA和RNA分析

快速验证RNA和DNA的纯度和浓度是一个特别广泛的应用。表1给出了他们分析中使用的波长和它们所指示的波长的摘要。在制备DNA或RNA样品时，例如用于测序等下游应用时，通常重要的是要验证两者之间没有污染，也没有被分离过程中携带的蛋白质或化学物质污染。

260 nm/280 nm吸光度(260/280)比值可用于揭示核酸样本中可能存在的污染，总结如表2所示。纯DNA的260/280比值通常为1.8，而纯RNA的比值通常为2.0。纯DNA的260/280比RNA低，因为在RNA中被尿嘧啶取代的胸腺嘧啶的260/280比尿嘧啶低。被蛋白质污染的样品会降低260/280的比值，因为在280 nm处有更高的吸光度。

用于吸光度分析的波长 在纳米	这个波长的紫外线吸光度表明存在什么?	是什么导致了紫外线在这个波长的吸收?
230	蛋白质	蛋白质的形状10
260	DNA和RNA	腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，尿嘧啶
280	蛋白质	主要是色氨酸和酪氨酸

表1:在确定260/280和260/230吸光度比时有用的紫外线吸光度摘要。

吸光度比值	典型值
260/280	纯DNA的典型吸光度比为1.8 2.0吸收比典型的纯RNA
260/230	吸光度比变化;RNA和DNA通常为2.15到2.5011

表2:DNA和RNA分析的预期紫外吸光度比总结。

260 nm/230 nm吸光度(260/230)比率也可用于检查DNA和RNA样品的纯度，并可揭示蛋白质或化学污染。蛋白质可以吸收230纳米的光，从而降低260/230的比值，表明DNA和RNA样品中的蛋白质污染。¹⁰硫氰酸胍和异硫氰酸胍是纯化核酸常用的两种化合物，在230 nm处有很强的吸收，这也会降低260/230的吸光度比。

药物分析

紫外-可见光谱学最常见的用途之一是在药品行业。^{12，13，14，15，16，17}特别是，使用数学导数处理UV-Vis光谱可以解析原始光谱中的重叠吸光度峰，以识别单个药物化合物。^12，17例如，局部麻醉剂苯佐卡因和抗生素金四环素可通过对吸光度光谱应用一阶数学导数同时在商业兽药粉末配方中鉴别出来。¹⁷通过为每种化合物建立校准函数，可以在微克/毫升浓度范围内同时定量这两种物质。¹⁷

细菌培养

紫外-可见光谱学常用于细菌培养．使用600 nm波长常规快速测量OD，以估计细胞浓度并跟踪生长。¹⁸由于细菌培养基的光学特性，以及在需要继续进行实验的情况下避免损坏细胞，通常使用和首选600nm。

饮料分析

鉴别饮料中的特定化合物是紫外-可见光谱学的另一个常见应用。咖啡因含量必须在一定的法定范围内，^1，19紫外线可以帮助定量。某些种类的有色物质，如蓝莓、覆盆子、黑莓和樱桃中的花青素，很容易通过匹配它们已知的峰吸收波长来识别酒使用UV-Vis吸光度进行质量控制。^20.

其他应用程序

这种技术也可用于许多其他行业。例如，测量颜色指数对于监测变压器油是有用的，作为一种预防措施，以确保电力安全输送。²¹测量血红蛋白的吸光度以确定血红蛋白浓度可用于癌症研究。²²在废水处理中，UV-Vis光谱可用于动力学和监测研究，以确保某些染料或染料副产品已通过比较它们的光谱随时间正确去除。²³它在食品真实性分析而且空气质素监测．

紫外-可见光谱学在一些更专业的研究中也很有用。跟踪与峰值吸光度对应的波长变化在检查特定结构蛋白变化时是有用的^24，25，26以及确定电池成分。²⁷峰值吸收波长的变化在更现代的应用中也很有用，比如非常小的纳米颗粒的表征。^28，29这项技术的应用多种多样，似乎无穷无尽。

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