mRNA中的脂质杂质:意义和解决方案
拯救生命的疗法和疫苗的发现和大规模生产比最初的合成要复杂得多。在整个开发和制造阶段，化合物可能面临各种复杂问题，例如传统分析方法难以检测到的杂质。最近在基于mrna的产品中发现的杂质可能是一个理想的例子。
许多制药公司依赖脂质纳米颗粒(LNPs)将mRNA疫苗运送到负责产生免疫反应的白细胞的淋巴结。LNPs一直是运营商的首选，因为它们生物相容性，易于放大，化学性质，提高细胞摄取．此外，对LNPs性质的研究有助于将其作为基因治疗的理想载体。
尽管LNP具有良好的性能，但使用LNP的风险在Moderna最近进行的一项研究，其中基于脂质组分之一的特定活性杂质共价结合mRNA，显著改变mRNA功能。此外，传统的检测方法无法检测到这种有关的修饰。
最近对精密纳米系统公司分析开发经理Adam Crowe博士的采访揭示了为什么这种新发现的杂质对mRNA功能有害，以及如何更准确地检测它。
可电离脂质氧化是有害的信使rna杂质来源
Kerstin Pohl (KP):您如何描述这种新型的信使rna杂质?
亚当·克劳(AC):我们讨论的不洁净是第一个
脂质加合物很可能是由叔胺氧化为n -氧化物引起的，n -氧化物分解形成对mRNA非常反应的醛。基本上，这个加合物是与mRNA共价连接的脂质。
KP:你如何预测这种mRNA杂质会成为mRNA- lnp开发者的一个问题?
交流:客户寻求适合其特定研究主题的纳米颗粒，因此存在广泛的可电离脂类，它们对氧化的敏感性差异很大。此外，某些类型的氧化容易与mRNA形成加合物，而其他类型的氧化则不会。你不仅需要识别脂质中氧化的存在，还需要识别脂质中氧化的类型，以破译它对mRNA的损伤程度。
由于这些脂质加合物与整个mRNA相比相对较小，传统的方法如毛细管凝胶电泳(CGE)，它可以监测mRNA的完整性，但无法识别它们。在较小的寡核苷酸生物疗法中，如siRNA，脂质加合物的小百分比并不足以影响寡核苷酸的疗效。mRNA的尺寸比siRNA大得多，所以每个mRNA分子的烷基化比例增加，尽管概率保持不变。
梅雷迪思·帕克的研究清楚地证明了脂质氧化杂质的存在，其相对丰度为105(10ppm)足以抑制整个mRNA的功能。这种特殊的信使rna杂质需要用尖端分析来强调。
完整性分析vs.碎片化
KP:什么是CGE为什么它们被用作mRNA杂质分析的标准?
交流:CGE为分析mRNA的完整性提供了一个可靠的分辨率。通过在整个制造过程中监测尺寸、质量和完整性，我们确保mRNA保持完整，并确定是否有制造步骤导致mRNA降解。不断发展CGE你可以分析多达9000个核苷酸的RNA结构。
CGE用于原料mRNA和mRNA- lnp偶联mRNA的分析，以确保其完整性。该方法通常优于反相离子对高效液相色谱法(RP-IP-HPLC)，因为它能更好地分辨高分子量的物种，这使其成为mRNA完整性分析的理想方法。除了早期开发阶段，我们还使用CGE用于质量测量，因为它是一种相对简单和可靠的释放测定方法G一批待用。
问题是可电离的脂质杂质加合到mRNA上并没有引起足够显著的重量差异。更具体地说，一个加合物将引起大约100-200 Da的质量转移，而mRNA在1-2 MDa的量级。即使每个mRNA有10个加合物，总的质量位移仍然小于整个mRNA分子量的1000分之一。此外，LNP可以在许多位点上氧化，但只有在叔胺上氧化才被认为是有害的。因此，检测氧化增加对决策是不够的。
解决这个问题的最好方法是通过碎片质谱分析你的脂质原料，看看有多少百分比的氧化与有害的n -氧化物形成有关。你只能从早期就降低这种新型mRNA杂质的风险。
KP:以前用于脂质碎片的标准质谱方法是什么?为什么在这个分析中没有帮助?
交流:碰撞诱导解离(CID)已被广泛用于分析生物分子的不稳定键，如酯键。问题是派生的片段通常不是诊断性的。CID不能提供全面的键断，这是了解分子不同部分氧结合所必需的，例如在烯烃和叔胺上。CID不会给出粘结断裂的范围，以区分不同类型的氧化。
KP:核磁共振(NMR)光谱学也可以用于分析可电离脂质中的氧化作用吗?
交流:使用NMR，样品的制备和表征非常耗时，更不用说高昂的成本了。很多纳米颗粒制造商不使用核磁共振。更重要的是，NMR中使用的探针没有动态范围来检测相对丰度约为10ppm的脂质氧化。
KP:你能告诉我们一些最新的液相色谱-质谱(LC-MS)方法吗?与之前的方法相比，你使用了这种方法来更准确地检测可电离脂质氧化?
交流:我们最近与SCIEX合作，后者开发了ZenoTOF 7600系统作为高分辨率质谱解决方案。ZenoTOF中的电子激活解离(EAD)方法帮助我们解锁脂质结构分析所需的分子细节水平。增加的动态范围使我们能够检测到非常低丰度的杂质，而EAD使我们能够更好地覆盖键断裂，使我们能够确定确切的氧化位点-包含氧或被氧化的官能团的链。
因此，我们设法区分不同的脂质氧化类型与微小的相对丰度。
一旦发现脂质杂质，就可以进行额外的纯化或修改合成过程，以降低与n -氧化物相关的风险。
利用脂质碎片获取结构细节
KP:你会把来自CGE以及LC-MS/MS和EAD，以便在一天结束时完全掌握mRNA-LNP产物?
交流:LNPs是分析复杂的材料。根据适应症和要求，您可以在任何地方对材料进行5到20种不同的分析。在mRNA分析中，每个方面的质量保证都是不容商量的。所以,CGE对于确认mRNA是完整的和有效的仍然是必不可少的，但你还需要质谱的结构细节，即EAD。你还需要描述原料(mRNA和脂质)及其结合物(LNP)，观察pH值、渗透压、5 ' -帽结构和mRNA的多聚腺苷酸化。其中任何一个都可能是生产失败点，所以目标是通过不同的数据获得产品的完整图像。
KP:这将对mRNA-LNP疗法和疫苗的未来产生什么影响?
交流:通过LNPs将遗传物质携带到靶标是一项非常强大的技术，我认为在不久的将来，不仅在COVID-19研究中，而且在肿瘤学和个性化医疗中，这种技术将得到更广泛的应用。它们的功能已在实验室环境中得到验证。问题是，在初步研究中，质量控制并不是最大的问题。一旦将这一成功转化为量产，就会面临一些风险，需要优化产品组成，证明正确的脂质行为，并确保下游加工参数正确工作。
如今，尽早消除所有下游流程的风险的趋势和需求更加强烈。到目前为止，LNP合成缺陷在制造过程中才被发现，而罪魁祸首通常是一种本可以更早预防的反应性物种。这对客户来说意味着大量的时间和资源浪费。
最先进的原料脂质分析技术，如EAD，使我们能够在产品生命周期的前几周(如果不是几天的话)内定位问题。然后，我们可以通知客户下游流程的潜在风险，并纠正不足之处。这些进步的最终好处是更快地进入生产和市场，对产品有更高的信心。
Adam Crowe博士采访了SCIEX基因治疗与核酸高级全球营销经理Kerstin Pohl。
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