188金宝搏备用技术网络探索CRISPR革命:艾米·巴特勒博士的采访
在本周的分期付款188金宝搏备用技术网络探索CRISPR革命我们关注的技术元素CRISPR技术。
CRISPR实验方法研究如何改变近年来?一些研究人员选择使用CRISPR装备的研究,而其他人可能决定使用“DIY”的方法。的优缺点是什么,以及为什么会选择采用1 /研究员?
帮助我们回答这些问题是艾米·巴特勒博士,生物科学部门的主席热费希尔科学。
主持人:请您能简要概述如何编程CRISPR-Cas机制基因编辑吗?为什么选择研究员利用CRISPR基因编辑工具而不是可用的替代方法吗?
艾米·巴特勒(AB):在高级别上,基因组编辑的过程中引入一个特定的DNA序列改变细胞的基因组内一个特定的网站。为此,科学家利用细胞的DNA修复过程来实现这些变化。所有当前基因组编辑技术在原有形式,无论是CRISPR,取得,或锌指核酸酶,用于启动这个过程通过引入在基因组DNA双链断裂(双边带)达到或接近所需的编辑。
根据编辑想要的类型,研究人员依靠电池使用两大类之一,DNA修复过程来完成所需的改变。如果研究人员创造一个有针对性的基因敲除的基因,然后他们很大程度上要依赖于细胞修复争端解决机构通过这一过程被称为异源端加入(NHEJ)。NEHJ是容易出错导致碱基对的插入或删除维修站点。这导致功能目标基因的敲除。
第二个编辑的广泛类别是通常被称为敲入编辑。这些更加优雅编辑创建精确的基因组的变化,我们思考当我们想到基因组编辑技术的承诺。这可以包括单碱基对变化到大块的外源DNA的插入。在这里,科学家依靠核心核酸酶(CRISPR、取得和ZFN)介绍网站的争端解决机构所需的编辑。敲入编辑,我们不仅提供基因组编辑核酸酶,但我们也为细胞提供我们称之为供体DNA分子协助修复。在供体DNA分子,我们编码DNA序列的变化,我们想介绍。捐赠时可用它使细胞对使用修复过程被称为同源性定向修复(HDR)。在HDR细胞利用供体DNA分子修复争端解决机构产生所需的序列变化的公司在目标站点。
可以使用任何有针对性的核酸酶在这一过程中但CRISPR作为首选基因组编辑核酸酶目前在市场上,因为它是最快和最容易的基因组编辑技术应用。针对一个新区域的基因组只需要用户创建一个新的指导RNA (gRNA)。然而,热费希尔科学和其他CRISPR一起继续开发其他技术。我们意识到,尽管CRISPR是一种通用的技术,有一些限制,可以使用其他技术(如解决。取得和锌指)。跨领域发展为一个完整的工具箱的编辑工具,让我们探索研究问题的广泛几乎所有细胞类型。
司仪:CRISPR实验方法研究如何改变,近年来先进吗?
阿瑟:最初开发的技术使用的DNA质粒提供核酸酶和gRNAs。虽然这种方法仍然很受欢迎,有了重大转变的直接交付Cas9蛋白质和合成gRNAs进入细胞。这种方法消除了多个低效的步骤在组装工具和交付的细胞,导致显著增加编辑效率(通常达到70%或更高),同时显著减少非目标的活动。结果是减少成本和工作量来确定和扩大编辑克隆,这些孤立的克隆成为一个更可靠的研究工具。我们开发了热费舍尔的TrueCut Cas9蛋白质和TrueGuide合成gRNA这个空间和他们继续保持优秀的主力编辑工具为我们的客户。
CRISPR的第二个方面取得了显著的进步是功能基因组学领域的筛选。高通量筛选的核心方法识别基因在特定的生理过程和疾病。传统方法依赖于RNAi技术认识不足,包括不完全击倒目标基因(s)和相对较高的日常活动。然而,CRISPR的好处能够产生一个完整的和永久的目标基因的淘汰赛RNAi相比,减少非目标效应。这反过来又可能导致更高质量的热门新兴从屏幕和加速研究项目通过帮助识别关键基因目标更快和更可靠。热费舍尔已经开发了LentiArray和LentiPool CRISPR库来支持这种类型的筛选。
主持人:现在有一个巨大的多样性CRISPR-Cas工具的范围。简单地说,每个Cas系统有何区别?
阿瑟:各种CRISPR-Cas系统描述了数以百计的细菌物种。这些变体如Cas12 / CPF-1和喉炎的症状。葡萄球菌Cas9与Cas9相比有不同的属性和目标要求喉炎的症状。化脓性链球菌(考虑WT cas9和主力CRISPR-Cas9系统用于大多数实验室)。目前的要求这些替代核酸酶通常导致更多的限制设计空间内的基因组和一般编辑效率往往远低于Cas9喉炎的症状。化脓性链球菌。这将是有趣的,看看这个空间发展在未来几年。真正的兴奋CRISPR的扩大空间的新变种喉炎的症状。化脓性链球菌Cas9使减少非目标效应,高保真Cas9变异使操纵的基因组基因表达没有永久的编辑,编辑和CRISPRi CRISPRa基地允许直接改变单一碱基对而不需要切割和引入一个供体DNA分子,和变异,可以改变表观遗传调控。
主持人:一些研究人员可能会选择使用CRISPR工具包的实验,而其他人可能选择一个“DIY”的方法。各自的优缺点是什么?为什么选择采用一种研究员?
阿瑟:我们认为plasmid-based方法为“DIY”的方法。总的来说,这是许多科学家的方法是第一次接触,因为它是首次报道的文献和质粒是现成的。这种方法的问题是,它往往更低效率和更高利率的非目标编辑相比,使用“改装”Cas9蛋白质和合成gRNAs解决方案,如TrueCut Cas9蛋白质和TrueGuide合成gRNAs。
事实上,Cas9蛋白质的使用,而不是质粒,结果在这种编辑效率的显著增加,研究人员现在可以经常进行实验在一个编辑池没有分离克隆的细胞。这带来了一大堆的可能性使用该工具在初级和非区分细胞。重要的是,这一跳从使用效率和减少非目标效应Cas9蛋白质和合成gRNA方法是一个关键的发展使CRISPR迅速从板凳上细胞疗法的临床应用研究。
主持人:我们如何继续发展CRISPR工具适用于各种细胞类型?
阿瑟:当讨论应用各种各样的细胞,围绕当前工具的局限性有效交付编辑工具的细胞。这就是为什么热费舍尔一直专注于交付系统的开发与交付的编辑工具。我们已经表明,耦合编辑试剂与氖电穿孔系统使我们的工具应用于各种各样的细胞从主力细胞系iPSC细胞和主细胞。在大多数情况下,我们可以找到一个协议来驱动高效的编辑,甚至在人类原发性t细胞等具有挑战性的细胞,我们可以经常开90%或更好的编辑效率。
主持人:研究人员在CRISPR-Cas实验仍然面临限制做什么?我们怎样能克服这些限制吗?
阿瑟:我们克服的局限性,使得系统更容易使用,整个过程的整体方法。我们继续关注开发工具在整个工作流Gibco媒体系统,交付平台如霓虹灯和Lipofectamine CRISPRMAX试剂、编辑工具包括TrueCut Cas9和TrueGuide合成gRNAs和下游分析工具来验证所需的编辑已经实现,我们还没有引入任何不受欢迎的日常编辑。通过整体分析,我们已经能够解决限制在不同的细胞类型,如iPSC或主t细胞和碟高级编辑效率,进而有显著影响的能力人员快速推进他们的研究项目。
艾米·巴特勒,热费希尔科学生物科学部门的主席,说着莫莉坎贝尔,科普作家、技术网络。188金宝搏备用
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