4提示成功的低温贮藏
低温贮藏是一个至关重要的程序,可以帮助您保护生物材料很长一段时间。尽管这是一个非常有效的方法,它包括试剂和技术可能会失败如果没有正确完成。在低温贮藏,其目的是使用低温保存结构完整活细胞/组织。适当的设备必须到位,以确保一致性、再现性和不育。正确的选择和数量的冷冻保护剂剂必须添加在正确的温度,和一个控制冻结之前必须应用标准化率低温存储的方法。本指南的目的是帮助你成功的细胞/组织的热力学的旅程37°C孵化器-196°C液氮储罐,长寿和繁荣。
选择适当的介质
第一步,以确保成功保存细胞/组织是找到足够的介质。换句话说,你必须检查你使用正确的媒介细胞/组织。
防冷冻的代理
冷冻保护剂保护缓慢冷冻细胞/组织4机制:降低高盐浓度,减少细胞收缩,降低解决方案的一部分,冻结和/或减少胞内冰的形成。不同种类的组合可能导致添加剂或协同增强细胞的生存。甘油、盐和二甲亚砜(DMSO)是最常用的冷冻保护剂。冰的形成可以消除如果用于极高浓度冷冻保护剂,至少50%的体积/体积。
细胞冷冻保护剂与低分子量,渗透细胞/组织,如甘油和DMSO浓度从0.5到3 mol / l,有效减少细胞/组织损伤缓慢冷冻细胞/组织。
细胞外的冷冻保护剂分子量较高,大于蔗糖,这不能穿透细胞/组织,如聚乙烯吡咯烷酮和羟乙基淀粉。这些化合物更有效保护生物系统冷却以快速的利率,因为他们导致玻璃化(细胞外玻璃形成)。在某些情况下,胎牛血清(的边后卫)可以添加在哺乳动物低温贮藏的解决方案,但它不是一个冷冻保护剂。
玻璃化
“Vitri”是指玻璃在希腊,它指的是细胞/组织内的晶状结构的形成。的确,玻璃化液体转换成玻璃,这种凝固由于粘度的增加而不是结晶。防止冻结期间要求组织里的水仍然是液体冷却和可以实现如果样品是玻化但存储,或略低于玻璃化转变温度。
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冰阻滞剂
一些蛋白质是冰阻滞剂,防冻性能;通过绑定到冰晶的冰结晶被抑制。合成冰阻滞剂已经开发出来,他们可能会加上“自然”蛋白质和常规冷冻保护剂提高细胞/组织的保护。
媒体低温贮藏
适当的防冷冻的解决方案可以替代细胞/组织的生理环境/媒介是嵌入式。缓冲区中应该包含特殊的冷冻保护剂基本freeze-induced伤害降到最低。
pre-freeze阶段细胞/组织应该受到冷却,具有减缓新陈代谢的目的,最大限度地减少缺血和缺氧的变化,减少化学毒性的冷冻保护剂。
样品可以打包pre-cooled冷冻保存方案0°C 4°C,然后转移到一个同样pre-cooled低温贮藏。另一个选择是使用一个控制冰箱。在这个阶段,你必须考虑到传统的组织培养媒体用于培养细胞/组织生理温度可能不是一个合适的媒介暴露在低温下。快速冷却可能由于热冲击是有害的,因此保留期间内离子和液压平衡组织冷却在媒体设计可以更好地控制身体限制这些温度引起的不平衡。最优解决方案必须调整离子平衡,提高同渗重摩。
如今,现成的解决方案,比如CryoStemTM最可靠,易于使用和安全选项。这样的一些使用解决方案的好处包括:无蛋白,适用于各种媒体,适合冷冻细胞培养在馈线和馈线免费条件和证明对人类细胞恢复效率高。CryoStemTM还包含甲基纤维素和DMSO溶液代替血清,消除与动物血清和serum-derived产品有关的风险。
一些准备工作/细胞可能需要额外的配方。总是读的描述和建议您将使用的试剂。
冷却速率
冷却速率可能显著影响细胞的生存。编程和均匀冷却率有效的长期存储和最大化的关键细胞/组织的可行性。
冷却速率可能会控制在4°C和至少-40°C。维护所有的样品冷却均匀性也非常重要,有些设备注入液氮和分发室由内置风扇,最小化标准偏差小于2°C运行时。最优缓冷条件导致保留细胞生存能力定义的冷却速度,允许一些细胞脱水,没有大量的胞内冰的形成。
对于一些哺乳动物细胞最佳的冷却速度是每分钟0.3°C和10°C之间。每个细胞都有一个冰冷的“框架”的冷却速率提供了最佳的细胞生存。
验证设备和冷冻方法
确保你有合适的设备和相应的冻结方法。
控制利率冻结设备的主要优点是速度控制保护潜热的释放结果post-cryopreservation细胞生存能力的提高。
最常用的方法有:液态氮的方法,直接温度反馈,定时脉冲,液氮冻结浸没或大跌,下台的方法。液态氮是最好的选择,因为它是化学惰性,不易燃的和相对较低的成本。
直接注入液氮温度反馈方法的室和监视示例比较实际的温度时,其温度程序室温度,并自动调整为低压液态氮供应,冻结速度,或有缺陷的电磁阀。
的定时脉冲方法,液氮注入的数量取决于阀门通径,坦克压力,阀芯耐磨性和电磁空缺,由低温冷冻速率编程。
在液态氮冷冻浸没或大跌,样品被加载到一个热块,块被淹没到氮。然后,加热器脾气氮获得冻结速率控制。建议少量低容量吸管和瓶。
下台的冻结法的样品放置在冰箱过夜,转移到-70°C冷冻一段时间,然后搬到氮蒸汽。
冻结协议
建议优化细胞/组织的冻结协议测试不同时间和温度来确定所需的步骤来获得所需的水平的细胞生存能力或组织功能。所选设备的制造商或介质可能推荐协议,或程序,可能产生可接受的可行性和他们是一个很好的起点。
一般协议用于2毫升样品尺寸,建议从成核1°C的速度到-40°C和10°C冷却速率每分钟-90°C端温度。
储存冷冻保存样品
作为一个经验法则,温度越低,时间越长可行的贮藏期。一些样品可能存储在-70°C的几个月或几年,但负责细胞恶化的化学反应并不完全停止在这个温度。样品在温度低于-130°C可能存储了几千年。
存储阶段
样品可能存储在气相或液相。液相的存储提供了一个统一的温度为-196°C。这种方法的缺点是包装材料(cryovials)可能泄漏和允许液氮进入包,因为氮膨胀气体加热,它可能会引起爆炸,除非气体样品恢复时可以逃脱。提示:打开瓶的盖子立即分散压力缓解这种威胁。
汽相存储提供了一个温度梯度,而不是一个统一的温度。存储在汽相减少交叉污染的可能性,但没有太多的安全裕度的存储时间。
存储系统或容器
主要的四个因素来选择最好的容器是成本(价格、质量、保修),消费(如液态氮损失率),样本容量和控制(温度、自动填充和监控)。
安全与质量控制
由于氮气是无色、无嗅无味的,它不能被人类的感官所感觉到,可能会导致头晕,导致昏迷和死亡。
密封容器不当可能会爆炸。将容器放置在气相氮之前几个小时浸泡在液氮最小化爆炸的风险。
样品污染的风险和用户受有害污染样本可以避免通过打开容器在一个安全的内阁。
安全建议用户应该穿防护面覆盖,绝缘手套、长袖衣服,防止接触液氮。总是使用容器用于低温液体,不密封或防止液氮发泄。使用固体棒测量棒,使用液态氮仅在通风良好的地区,不要往容器中。去污的协议应该是发展以立即采取纠正措施。总是更新每个机架的信息,盒子和所有的样品信息:类型、日期、负责人等。
恢复协议
的主要挑战之一是如何让细胞/组织回到生活的最佳形状。在哺乳动物胚胎可以减缓气候变暖的情况下对生存至关重要,因为它允许足够的时间对细胞补液和溶质积累逐渐丧失。细胞冻存的慢慢变暖,小冰晶核倾向于增加再结晶,造成细胞损伤。细胞可以快速解冻,因为他们积累相对较少的溶质在快速冷却,和再结晶几乎没有机会出现在快速变暖。一个良好的实践逐步稀释的冷冻保护剂,在适当的时间间隔,保持细胞损伤和稀释体积低于阈值存在非渗透性冷冻保护剂的溶质(蔗糖),防止细胞肿胀溶质扩散的细胞。
引用
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