7个技巧来提高你的Western Blot

蛋白质是细胞的分子机制，确保体内的每个细胞都能发挥其特定的作用。科学家们经常希望研究蛋白质，实现这一目标的一种方法是western blotting。这是一种利用抗体从生物样本中的混合物中识别感兴趣的蛋白质的技术。首先，通过凝胶电泳将样品按分子量分离。然后将蛋白质转移到固体膜(硝化纤维或PVDF)上，然后进行阻断步骤以防止抗体非特异性地结合到膜上。感兴趣的蛋白质是用一种特异性抗体来检测的，最后用一种二抗来检测，通常与荧光团偶联。然后可以扫描膜，使感兴趣的蛋白质可视化。

在我读博士的头几个月里，我尝试了很多西方的墨迹(我以前只读过一些东西，我的意思是，在一个干净的墨迹上画一个漂亮的单带有多难?)这绝对不像我想象的那么容易-我得到了不同的结果与每一个污点和我的污点总是充满斑点的背景。

这促使我在制作完美西部片的过程中进行了大量的故障排除，在这里我将提供一些如何实现这一目标的技巧。

干净的一切

这一点怎么强调都不为过。盘子或薄膜上的任何污垢、灰尘或剩余的凝胶都会在污渍上显示出来。而且，因为生活是不公平的，对我来说，背景似乎总是与我的波段应该在的地方一致，因此干扰了任何后续的量化。防止背景的一种方法是用1%的SDS或70%的乙醇清洗所有的板和梳子，然后用蒸馏水擦干。此外，确保你总是戴着手套，所有其他设备，如产钳，也都是干净的。

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制作最好的凝胶

有时，在进行western blot之前，会花费数小时的工作来准备样品;但如果凝胶没有准备好，你所有的努力都可能付诸东流，这将是一个巨大的耻辱!

遵循食谱

确保溶液的组成正确，pH值正确;堆积凝胶在pH值6.8时通常呈酸性，分离凝胶在pH值8.8时呈碱性。

丙烯酰胺的比例

你使用的丙烯酰胺百分比与蛋白质在凝胶中移动的难易程度成正比。如果你想要的蛋白质分子量很低，而丙烯酰胺的百分比又太低，那么它就有可能从凝胶中流失。在开始准备凝胶之前，检查蛋白质的分子量，并决定哪种凝胶比例最合适。

给凝胶足够的时间聚合

通常我会准备更多的堆叠凝胶和分离凝胶，因此我可以检查我准备溶液的管子，看看它们是否已经聚合，而不是操纵凝胶本身。我发现，制作新鲜的10% APS可以改善凝胶的聚合，而且准备时间不长。如果凝胶没有正确聚合，这可能会导致“波浪”带。在这个阶段最好要有耐心!

不要让凝胶变干

在倒入分离凝胶后(确保你有足够的空间来堆叠凝胶和梳子)，在它聚合的时候用水合异丙醇填充空的空间。这将确保你在分离凝胶的顶部有一条平坦的线，而且它不会变干!在分离凝胶聚合后，你可以倒出你的覆盖溶液，用ddH2O冲洗干净，然后把你的堆叠凝胶倒在上面。在你准备好凝胶后，一定要很快使用它，并尽量避免让它在室温下突出。如果你提前准备了凝胶，有一些方法可以储存它们以备将来使用。你可以用SDS Running Buffer浸泡过的纸包裹它们，或者在凝胶上倒一些ddH2O，密封在自封袋中，凝胶可以在4°C保存几天。如果凝胶开始在边缘收缩，最好是重新开始!

Red-to-Red, Black-to-Black

每次做western blot时，我都要对自己重复这句话至少100次!如果电极被插入错误的正负极插座，电场就会反向，你的样品就会以错误的方式流出凝胶。这是一个很容易犯的错误，但几乎不需要任何时间来仔细检查。

将蛋白质从凝胶转移到膜上

蛋白质“跑到红色”或“跑到阳极”

要记住换乘三明治上的内容，一个简单的方法就是“run to red”。如果你认为蛋白质会从凝胶流入你选择的薄膜，你的凝胶需要在带负电的黑色一侧(阴极)，而你的薄膜需要在带正电的红色一侧(阳极)，这与电流流动的方式是一样的。

正确处理你的膜!

一定要戴手套，确保产钳清洁，并将转移三明治中的气泡滚出来。就像我之前说的，灰尘和污垢会出现在你的污渍上!气泡会阻止蛋白质从凝胶迁移到膜上，为了避免这种情况，你可以使用一个小滚筒或50ml塑料管的边缘来推掉转移三明治中的任何气泡。

不要让转盘太热

储罐传输会产生大量的热量，这在传输过程中会引起问题。为了克服这个问题，要确保传输缓冲是预先准备好的，并且有足够的时间冷却(它总是可以在前一天准备好)。通常情况下，吸墨纸可能会与冰袋，可以插入到水箱，这将有助于保持温度下降。在转移凝胶之前，确保你的冰袋填满并冷冻!此外，你可以在冰上或寒冷的房间里进行转移。降低电压和降低传输时间也可以减少传输过程中产生的热量。你可以尝试不同的时间/电压，找出最适合你和你的蛋白质!

检查你的转学是否成功

在进行阻断和免疫检测步骤之前，验证蛋白质是否已经成功地从凝胶转移到膜上是有用的。这可以通过Ponceau-S等蛋白质染色快速而容易地实现。通过这种方法，您还可以判断在转移过程中是否存在任何问题，例如不均匀的转移或气泡困在转移三明治中。你可以利用这段时间用铅笔标记薄膜的方向，如果你没有可见的梯子，这尤其有用!

阻塞和洗涤

现在，这些可能是最小化胶片背景的最重要步骤。

阻断是通过阻断非特异性抗体结合位点来增加抗体特异性的关键步骤。为了堵塞我的细胞膜，我在TBS-T中使用了5%的BSA。我采用的一个技巧是在使用之前过滤这个解决方案，这可以去除任何可能作为背景出现的颗粒。我通常会在室温下阻塞细胞膜1小时。其他常用的阻断剂包括脱脂奶粉。

在每个抗体孵育步骤后用TBS-T清洗膜是必要的。我清洗我的膜3次，每次5分钟，轻轻搅动。这将去除任何未结合的抗体，从而减少背景!

抗体

有必要测试一系列不同浓度的抗体，并找出在你的污点上最好/最干净的条带。抗体制造商通常在他们的数据表中提供这一信息。抗体太多，你可能会在印迹上看到过多的背景，抗体太少，你可能什么都看不到。

确保在测试抗体时包含对照。例如，二抗是否会在没有一抗的情况下产生条带?如果是这样，可能会导致假阳性结果。

一定要仔细检查你的抗体的种类反应性，以及它们是否与你的样本兼容。

检测

我使用来自LI-COR的IRDye偶联抗体，可以通过他们的奥德赛®成像系统检测。这些染料可以在700nm或800nm通道中检测到。

排除你的抗体浓度问题——如果你有太多的次级抗体，你就会冒着与细胞膜非特异性结合的风险，你会有很多的背景!此外，过多的二次信号可能会绑定到你感兴趣的波段，使信号饱和，这样你就无法量化了。我通常在奥德赛®扫描仪上以各种强度手动扫描我的膜，因此我可以知道什么时候信号最大。

当检测700nm和800nm通道中的蛋白质时，请确保您的辅助仪器在正确的通道中专门检测正确的蛋白质。高度交叉吸附的二级推荐用于检测两个通道中的蛋白质，因为它们不太可能相互交叉反应。