ELISA成功的8大秘诀

ELISA因其简单、特异性和成本效益而受到青睐，是全球许多实验室使用的有用技术。用于广泛分析物的ELISA试剂盒可以在商业上购买，尽管这些试剂盒往往价格昂贵，资金通常紧张，特别是在研究环境中。这导致许多实验室开发自己的分析方法，特别是在预算有限或需要分析许多样品的情况下。尽管该技术总体上易于使用，但仍有许多因素需要考虑，以便设计可靠的分析方法。以下是我在这一过程中所经历的一些经验，希望能帮助你节省时间、压力和金钱，并帮助你获得尽可能好的结果!

1.明智地选择你的表面

由于酶联免疫吸附试验中用于包衣的蛋白质的多样性，有广泛的专业微板可供选择，这些微板具有不同的结合特性和能力。在开发一种新的检测方法时，应评估一系列表面，以确定哪一种表面最适合检测抗体/抗原。大多数板材由相同类型的塑料制成，如聚氨酯或聚氯乙烯，但它们具有不同的结合性能。至少值得尝试几种低、中、高结合能力的塑料。在选择塑料时，成本也是一个重要的考虑因素，特别是在需要测试大量样品的情况下。此外，用于涂层板的分子应适当滴定，以确定在测定中使用的最佳浓度。

2.棋盘格

虽然在检测中使用高浓度的抗体似乎是明智的，特别是当检测到的分子在样品中不是很丰富时，这可能是违反直觉的。正确滴定所有用于检测的抗体和样品，确保信噪比是最佳的;其目的是获得尽可能低的背景和尽可能高的光密度(OD)，以便设计良好和灵敏的测定。在使用过多抗体的地方，由于非特异性结合，背景噪声会很高。浓度过低时，检测将失去灵敏度。一种有效的测试方法是对用于包衣、样品和二抗(加上任何其他抗体，例如设计夹心ELISA时)的分子进行一系列的稀释，并对每种条件进行阴性对照，对它们进行相互测试。这样就可以在几个简单的实验中确定每种药物的最佳浓度。还可以同时分析多种类型的塑料。

3.适当的样品稀释是关键

在研究测定法的变异性时，样品的适当稀释常常被忽视。当样品在使用前需要稀释时，如使用血清时，逐步稀释是最小化移液误差的关键。例如，如果一个棋盘实验已经确定血清在加入培养皿之前应该稀释1:10，那么明智的做法是对样品进行1:10的稀释，然后再进行1:10的稀释。虽然这似乎是显而易见的，但这通常不会进行，并且会在实验之间产生巨大的差异，这对研究人员来说是令人沮丧的，可以很简单地避免，提高分析的可靠性。在同一实验中比较样品时，不当的稀释也会产生误导性的结果。例如，如果比较两个血清样本以确定是否发生了血清转化，如果由于稀释技术差而添加了太多的转化前样本，则稀释不当的样本可能意味着错过了血清转化。

4.并不是所有的抗体都是平等的

虽然这可能并不总是可能的，但如果有多个感兴趣的蛋白质抗体可用，最好是每一个都测试。在选择抗体时要考虑很多因素。多克隆抗体具有更广泛的靶点范围，而且通常更便宜，但可能会降低检测的特异性。单克隆抗体通常更昂贵，但如果抗体所使用的表位在目标抗原上可见，则更具有特异性(但如果不可见，则可能根本不结合)。通常，测试这一点的唯一方法是尝试来自不同制造商的一系列抗体。值得庆幸的是，许多制造商为此目的提供小样本量，或者如果被要求，他们愿意提供这些样本量。在选择用于夹心elisa的抗体对时，这种选择变得更加重要，因为抗体必须识别彼此不同的表位。

5.小心阻塞惊喜

许多研究人员在分析的开发阶段试验了一系列阻断剂，并选择使用能提供最佳信噪比的阻断剂。在做出这种选择时，经常要考虑的一个因素是特定阻滞剂的批次之间的差异。阻滞剂通常是生物制剂，如牛血清白蛋白(BSA)。牛血清白蛋白在广泛的检测中是一种非常有效的阻滞剂，但由于试剂的性质，它在批次之间可能差异很大，一些批次含有大量的交叉反应抗体，这会干扰实验，而一些批次含有很少或没有。因此，如果选择了BSA或胎儿小牛血清等阻滞剂，在使用给定的一种之前，谨慎地测试几批以检查结果的一致性。这是一个重要的考虑因素，对于不走运的人来说，一旦最初测试的批次已经用完了，许多实验失败的原因就会出现!如果批次与批次之间存在差异，但阻滞剂的选择无法修改，通常制造商很乐意保留特定批次的阻滞剂，如果他们征求了意见，并知道将使用多少。

6.二抗批量检测

与阻断剂类似，二抗的批次也可以不同。虽然它们的整体活动可能不会改变，但不同批次所需的量可能不同。在购买另一批二抗时，值得对前一批进行简单的实验，以确保所使用的浓度仍然合适。假设可以使用相同的稀释，有时可能意味着当批次改变时，背景噪声突然变得更高，这可能是一个令人讨厌的惊喜!

7.别忘了正常化!

通常被忽视的是，归一化处理了板/实验之间的任何变化，并将其对整体结果的影响最小化。将血清用作分析物的实验之间进行归一化的一个简单方法是将每个血清样本的结果与阴性血清对照进行比较。通过这样做，任何来自外部因素(如室温和开发时间)的变化都被最小化。将测试样品的OD值除以对照组的OD值，结果可以表示为折叠变化。虽然这不是绝对的量化，通常也不需要一个绝对的数字，但仍然可以获得一组可靠的结果，并且可以相互比较样本。

8.了解你的动态范围

当设计一个用标准曲线来确定样品浓度的实验时，重要的是要保持在你用来读取板的仪器的动态范围内。这些值将在制造商手册中指定;许多机器的上限是~1.5 OD。在编制标准曲线时，顶部标准(即最集中的)的OD必须低于动态范围的最高值。通过使用高于此范围的标准，根据标准曲线进行结果外推变得有风险，因为任何高于此数字的外径都可能是不准确的。许多较新的平板阅读器模型能够调整动态范围，但如果您使用的模型无法做到这一点，则需要在标准曲线设计中考虑最大外径。所有样品也必须落在这个动态范围内，以便准确测量和确定浓度，所以样品稀释也必须考虑。一开始这可能会令人沮丧，但一旦操作员对一批样品中的浓度范围有了感觉，就可能使用符合该范围的标准稀释样品，并为未来的实验提供良好的结果。