低温贮藏:应用和进展

低温贮藏的主要方法为生物标本保存多年。它允许研究人员使用稀有或珍贵的样本几十年前回答新的研究问题。现在保存最新的复杂的细胞模型用于其他科学家在未来使用和储存和供应至关重要的生物治疗。在本文中,我们探索的挑战与低温贮藏和新兴的进步可以改善这些方法。

低温贮藏是什么?

低温是希腊语“霜”低温贮藏包括冷冻细胞,组织,器官或任何其他生物材料在非常低的温度。

有几个方法实现:研究实验室中最常用的方法是冻结在-80°C使用固体样品有限公司₂使用液态氮或−196°C。但称为玻璃化方法用于冻结临床样本如精子、受精卵或卵巢组织长期储存。主要的区别在于,传统的低温贮藏方法允许在保存过程中冰形成而在玻璃化整体解决方案是没有任何冰结晶凝固。¹在本文中,我们将关注传统低温贮藏最通常用在实验室。

应用低温贮藏

传统的低温贮藏是一种高效的方法来存储细胞和组织,可以通过保持细胞“假死” ——伊克巴尔‎康桑格研究所,生物资源经理解释说。“冷冻细胞,它停止的代谢活动和保护酶等细胞内化合物。”

没有低温贮藏必须保持细胞和组织的活力在连续文化——这意味着生长和分裂产生更多的细胞(称为使)。但细胞改变,因为他们将随着时间的推移,这可能导致他们失去重要的特征。通过冻结,它减少了异质性,否则会使引入的反复。

“从我们的角度来看,低温贮藏允许我们银行新细胞模型研究社区,人们可以回到几年,”说夏洛特海狸博士威康桑格研究所的高级科学经理谁开发复杂的系统,如瀑样细胞模型。“这意味着我们可以保持长期的模型,但它们不是不断分裂,他们几乎代表了细胞突变。”

低温贮藏的一个领域是变得越来越重要迅速的新兴领域细胞治疗:例如,保护间充质干细胞移植,或嵌合抗原受体T细胞(汽车T细胞)治疗癌症。CAR-T细胞疗法,病人的T细胞移除,重新识别抗原(如肿瘤相关抗原),然后返回。“你必须做很多处理这些细胞,可能移动站点之间的细胞,让他们从病人当他们捐赠给实验室,然后再回病人,可以很容易地降解和细胞,”解释道教授马修·吉布森华威大学的生物材料科学家。“治疗这样的理想需要冻结的格式,让你在床边,然后迅速解冻他们管理他们的病人。一旦你要做大量的处理在医院设置,创建一个障碍,所有这些步骤引入大量成本。这些都是极其昂贵的治疗,所以任何使这个过程更有效率和结果越来越健康细胞冷冻后对病人有好处。”

低温储存动物细胞培养

保持健康,细胞培养是一个要求很高的任务更加困难通过事故或损失的存在污染。这些问题可以减少使用低温保存,一个过程,有效地将细胞转变成真正的假死。下载这个指南,发现细胞内和细胞外的事件在细胞冷冻和冷冻细胞培养的优点。

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低温贮藏的局限性

的一个主要的限制目前的低温贮藏方法是冷冻后细胞的回收率。虽然在一个研究项目你可能有时间等待你的细胞生长数量,为临床应用如上面提到的,这是不可能的。

在冻结过程中,冰晶形成样本和破坏细胞内的一些细胞无法恢复。大多数实验室和临床协议使用冷冻保护剂保护细胞免受冰晶和/或控制速率冻融避免令人震惊的细胞突然的温度变化。

许多不同的冷冻保护剂,但最常见的冷冻保护剂用于哺乳动物细胞和组织是二甲亚砜(DMSO)。其他选项包括甘油对细菌细胞和红细胞。但冷冻保护剂有自己的缺点;DMSO浓度被认为是最好的保护剂但在某些细胞是有毒的 。甘油作为冷冻保护剂该报对细胞,但不那么有效而DMSO溶液。²减轻潜在的毒性问题的一个方法是使用冷冻保存剂的不同组合,如补充DMSO溶液的浓度较低与甘油或聚丙二醇。²

也有一些主要的细胞类型,只是不喜欢被冻结在冷冻保护剂的解决方案,从而提出了挑战。“急性髓系白血病(aml)外周单核细胞更容易冻结比淋巴瘤细胞和恢复,如果你是冻结样品,你还不知道什么是恶性肿瘤,那么你需要非常小心地对待他们,”伊克巴尔解释道。“同样,不同类型的健康血细胞冻结不同——T细胞可能恢复好,尽管他们功能可能会受到损害,而粒细胞不会恢复。”

“小说复杂的模型如瀑样来自病人样本,然后我们有失去的危险模型,”海狸解释道。“使用瀑样的优点之一是,它们是由不同的细胞群代表自然的异质性,你看到在一个组织或肿瘤。冻结使之通过瓶颈如果瓶颈过于苛刻的一些细胞,你失去了异质性也不是这样一个好的模型了。”

另一个考虑是样品的最终用途。例如,RNA是比基因组DNA对温度变化敏感得多,海狸说:“人从年前挖出了骨架,还是所有的DNA序列,而RNA会降低如果是- 80°C的冰箱开了太多次了!“这对冷冻样本构成的问题如果你还不知道你计划如何使用它们。

”如果你有非常有限的组织,你必须决定什么是最好的方式来保护这个材料分析方法改进,”伊克巴尔说。“我记得当我开始可能18年前,我们会得到非常大的淋巴结活检组织比我们可能使用所以能够以多种方式保存,而现在核心活检是诊断和流行你有非常有限的材料保护为研究目的。”

细胞冷冻保存的基础知识

低温贮藏已成为常规练习在生物医学研究和临床医学。当冻结并保持正常,标本可能无限期地在悬浮细胞的新陈代谢,可以根据需要解冻。收获的好处这一过程,重要的是要有一个全面的了解低温贮藏的关键方面。下载这个指南的基础细胞冷冻保存的研究和临床使用。

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低温贮藏的进步

有两种主要的进步可以改善低温贮藏,海狸说。“中档自动化就是缺少市场。即使你只有冻结30到50瓶的东西,不一定每一天,它还是人体工程学的一个挑战人们在实验室里。”,除了机器人,其它区域需要改进在DMSO找到替代品,这些物质都对细胞。胎牛血清通常使用DMSO提供进一步支持细胞的蛋白质。但这些都不是理想的冷冻干细胞,为例。“没必要活细胞如果他们分化你不想让他们的路线。如果你将这些细胞注入这些人,例如,细胞移植,那么你需要的血清替代动物。”

“DMSO-based低温贮藏是一个很好的方法,但我们真的需要考虑事情的效率,”吉布森同意。冻结”对许多细胞类型我们通常使用标准方法我们可能只有20至60%的细胞冷冻后。如果我们可以得到这个数字更高,那么我们可以从冰箱小批量删除,或者使用罕见的主要细胞或细胞更难文化和扩大,然后恢复越快越多你可以做你的研究,或者你可以做更多的实验每批。”

解决这种需求,吉布森正在研究仿生材料,和一个他们一直模仿的蛋白质被称为防冻剂蛋白质,或一个ice-binding蛋白质。³“这些都是蛋白质,能选择性地绑定到冰。他们可以区分液态水和冷冻水——很显著。“这些ice-binding蛋白质是由大量的物种,最著名的鱼发现地球的两极。蛋白质绑定冰晶阻止他们成长,这样鱼就可以生存在较低的温度比鱼没有蛋白质。“原来有不少蛋白质和多糖做或停止冰形成或控制方式和形式。如果我们能模仿,在合成聚合物,然后我们可以改变我们冻结细胞受到大自然如何保护自己在寒冷。“团队已经表明,他们可以使用冷冻保护剂的聚合物减少,同时冻结细菌细胞。⁴

另一个发展是能够冻结细胞已经连接到组织文化板块,吉布森说。“细胞悬浮,你必须把它们放到盘子和让他们增长之前,您可以使用它们。我们感兴趣的是如何冷冻细胞在这些板块,这样你就可以把它们从冰箱中,他们可以使用了。“吉布森的实验室已经开发了一些材料,工作不是影响冰,但是通过这个冻结过程中有效地保护细胞。⁵“我们发现这些细胞复苏的显著水平。我们的最激动人心的结果之一是通过添加polyampholyte单层细胞,组织培养塑料,而且我们看到大幅增加从< 20% > 80%的细胞恢复。”⁶

这冻结的科学研究不仅仅局限于生命科学,它被应用于从制作冰淇淋味道奶味更浓,避免混凝土冻融损伤更少的脂肪。⁷

“如果你能使研究更有效,这是一个很好的结果,但是这类研究也有助于解决基本问题如何影响这些低温生活和我们如何可以储存东西更好,更有效率。”

引用

1。 Tavukcuoglu年代,Al-Azawi T,卡其色AA, Al-Hasani年代,et al。玻璃化冷冻保存的标准方法。中东Fertil。Soc。J。2012;17:152 - 156。doi:10.1016 / j.mefs.2012.07.007。

2。 Awan M, Buriak B,斑点R, et al。二甲亚砜:自从低温生物学中扮演着关键的角色,毒性效果的平衡?再生医学2020;15 (3):10.2217 / rme - 2019 - 0145

3所示。 木匠摩根富林明和汉森TN。防冻剂在低温贮藏蛋白调节细胞生存:中介通过对冰晶体生长的影响。《美国国家科学院刊。1992;89 (19):8953 - 8957。doi:10.1073 / pnas.89.19.8953

4所示。 哈桑,Fayter AER,吉布森MI。冰再结晶抑制聚合物使glycerol-free低温贮藏的微生物。《生物高分子2018;19 (8):3371 - 3376。doi:10.1021 / acs.biomac.8b00660

5。 斯塔布斯C,贝利TL,穆雷K,吉布森m . Polyampholytes新兴大分子冷冻保护剂。《生物高分子7 - 17 2020;21 (1):。doi:10.1021 / acs.biomac.9b01053

6。 贝利TL,斯塔布斯C,穆雷K,托马斯RMF,欧登L,吉布森MI。综合可伸缩的聚(两性电解质),大大增强了细胞冷冻保存。《生物高分子2019;20 (8):3104 - 3114。doi:10.1021 / acs.biomac.9b00681

7所示。 弗雷泽SD,彼此毫克,Osio-Norgaard J,每天一个,Delesky EA Srubar西弗吉尼亚州。抑制水泥浆和混凝土的冻融破坏模仿大自然的防冻剂。细胞物理科学报告2020;1:100060。doi:10.1016 / j.xcrp.2020.100060。