基于片段的方法提高药物发现效率

识别临床有价值片段的能力是加速药物发现的关键。

药物研发既昂贵又耗时。药物发现的生产力与识别可用于靶向临床相关通路的药物样分子的能力有关。在过去的二三十年里，基于碎片的药物发现(FBDD)已成为高通量筛查(HTS)方法的补充方法。FBDD基于使用小块化学片段与蛋白质靶点的活性位点结合的理论概念，因为单个化学官能团可以影响药物与其靶点之间的结合能量。此外，由于片段具有简单的结构，来自侧功能组的不希望的交互的可能性较低，这种交互可能使实际的绑定亲和力复杂化。

FBDD的另一个优势是，片段库比HTS的化学空间大得多，可以定期产生优化命中。重要的是，碎片的命中率可以用来评估生物靶标是否具有潜在的药物作用，即使是更复杂的靶标，如蛋白质- dna相互作用。在本文中，我们将介绍FBDD领域的最新进展。

验证来自FBDD的攻击

与HTS相比，片段的亲和性较弱。平衡解离常数测量结合药物/靶标复合物解离为游离药物和靶标的倾向。对于FBDD，这大约是1 mM到100µM，而对于HTS方法，这大约是100 nM到10µM。因此，为了准确地测量碎片与其靶标之间的亲和性，需要灵敏的生物物理方法。一些常见的例子包括表面等离子体共振(SPR)，热位移亲和捕获，x射线晶体学和核磁共振(NMR)。

x射线晶体学是一个强大的工具，以获得蛋白质和配合物的结构在高分辨率。由此得到的x射线结构可用于了解抑制剂与靶标活性位点的结合机制，以及活性位点共价键的形成。它通常用于片段命中识别和验证。使用这种方法，碎片必须在高分辨率下结晶以获得其结合机制。

“当涉及到选择x射线晶体学、核磁共振和SPR等技术用于FBDD时，我们需要知道什么更重要:结合还是相关性。使用x射线晶体学，主要的优点是可以直接看到结合位点上的靶蛋白片段。没有必要推断这些信息，尽管质疑绑定是否相关是很重要的。同样重要的是要注意，与SPR等生物物理方法不同，x射线晶体学不提供信号强度的差异，研究人员将其用作衡量片段与目标相互作用强度的代理。弗兰克·冯·代尔夫特教授他是牛津大学的首席研究员。

“在我看来，使用x射线晶体学进行FBDD有两个主要挑战。首先，缺乏系统的方法来获得一致和高质量的碎片晶体，以提供可靠的结构信息。其次，需要足够强大的计算工具来快速可靠地分析晶体的结构信息。尽管如此，我对x射线晶体学用于FBDD持乐观态度，因为它能够提供‘丰富’的信息来指导碎片研究和修改，”von Delft补充道。

根据朱利安·沃茨医生他说，虽然x射线晶体学仍然是目前最有效的三维结构阐明方法，但它并不是一种可靠的筛选方法。在他的研究中，奥尔茨开发了核磁共振方法来改善药物发现过程。

“核磁共振探测了更大的化学空间，因为核磁共振不需要结晶来定义一个片段是否为真阳性/粘结剂。核磁共振是筛选的金标准，使用这种方法也有可能获得配合物的结构。”

核磁共振是一种高度敏感的技术，可以识别从nM到mM范围内具有不同结合亲和力的片段，并且还提供了较低的假阳性率。这是通过测量来自片段/配体或目标/蛋白质的核磁共振信号的变化来实现的。虽然化合物混合物可用于筛选，但由于信号重叠，可识别的化合物数量有限。各种同位素可用于FBDD的核磁共振，包括氟-19和磷-31。然而，传统的核磁共振结构计算方法是低效的，不能为药物发现时间表提供及时的信息。

在Orts领导的一项研究中，Torres等人开发了核磁共振分子替代方法(NMR2)，该方法可以通过使用已发表的靶蛋白结构，并将观察到的核Overhauser效应视为不重要的约束，从而减少生成配体-蛋白质复合物结构所需的时间。该方法首次发表于2020来解决一个片段的三个衍生物和蛋白质受体PIN1(一种肽基脯氨酸)之间的复合物独联体/反式异构酶在几种癌症中过度表达，识别磷酸化丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸基序，有助于肿瘤的起始和生长。最近，同一组采用NMR2方法来理解bromodomain的绑定模型，这些模型可以识别BRD4和TRIM24的翻译后修饰，这些蛋白质也与癌症有关。

“FBDD从项目一开始就提供了更好的化学空间，因为碎片简单多样。从一个片段到一个更复杂的分子的任何修饰都大大减少了化学空间。所以，从简单的‘块’开始，就有可能覆盖尽可能大的化学空间，只有在有意义的情况下才可以缩小搜索范围。”

Orts希望将他的NMR2方法应用于其他靶标:“KRAS是我目前试图用片段给药的靶标。KRAS不能很好地结晶，因此x射线晶体学在这种情况下没有帮助，并提出了一个主要问题。KRAS也是非常动态的，灵活的区域(循环)在其功能中起着至关重要的作用。核磁共振本质上更适合于研究柔性受体。我们正在用片段复合物解决KRAS的NMR2结构，以加速针对这种癌蛋白的药物设计，”Orts补充道。

连接片段

在找到命中的片段后，该片段可以生长成具有更强效力的化合物。这种策略被称为片段增长。另一种创建有效化合物的方法是利用碎片合并，当碎片有重叠的结合位点时，可以通过x射线晶体学确定。这也可以通过使用NMR和分子对接分析片段与目标活性位点的结合模式来促进。最强大的方法是片段链接，其中连接两个或多个片段以显著提高绑定亲和力。例如，将两个具有mM范围内绑定亲和性的片段连接在一起，将产生具有nM范围内亲和性的化合物。然而，为了使这种方法工作，目标通常有一个相对较大的绑定口袋，以便片段绑定到口袋内的不同区域。广泛的结构信息对理解分子相互作用也很重要。

脓肿分枝杆菌Mab是一种快速生长的非结核分枝杆菌(NTM)，是囊性纤维化患者的主要威胁。磷酸基氨基咪唑琥珀羧酸酰胺合成酶(PurC)是一种必需的酶新创细菌中嘌呤的生物合成。由于PurC与人类同源物PAICS具有明显的结构差异，因此它是抗菌药物发现的一个有吸引力的靶点。Charoensutthivarakul等人。利用FBDD方法，如片段生长和片段合并，发现一类新的4-氨基-6-(吡唑-4-基)嘧啶基抑制剂。

筛选两个片段文库，筛选出35个片段，x射线结晶学分析发现60%的片段与Mab PurC的ATP位点结合。在结构信息的指导下，作者利用各种官能团的添加和删除来提高绑定亲和力。重要的是，作者利用命中片段1和2整合了片段生长和合并策略，生成了两种化合物，在50-150 nM范围内(从> - 300 uM范围内)具有明显更好的结合亲和力。这种方法突出了FBDD在加速药物发现中的整体击中-先导进展方面的优势。最近也有类似的策略使用Smith等人发现了MRTX1719，一种用于治疗癌症的合成抑制剂MTAP删除。

“在这篇论文中，我们使用了片段生长和合并来开发PurC的有效抑制剂。这些策略来自于对内部片段库以及钻石同步加速器片段库的筛选。我们利用这两种筛选的结构数据来开发这些抑制剂。安东尼·科因博士他是剑桥大学的首席研究助理。

“虽然片段生长是最常见的细化方法，但在以前的药物化学活动中也使用了片段合并。然而，其中一个关键方面是高质量结构数据的可用性。在我们对PurC的工作中，我们能够开发出用于x射线晶体学的坚固晶体，在这个项目中，我们很幸运地解决了30多个对我们的战略至关重要的结构。我们已经能够开发高亲和力抑制剂，这些抑制剂已经被结构生物学所告知，适用于广泛的不同靶标，例如RAD51-BRCA2，MurB而且TrmD．药物化学与结构生物学之间的相互作用是上述所有项目的关键，”Coyne补充道。

前进

FBDD有可能提高药物发现的生产力，使更多的药物被批准用于临床，使患者受益。然而，片段与靶标的结合较弱，需要在x射线晶体学和核磁共振等技术上不断进步，以提供高分辨率的结构信息和分析配体-受体相互作用。合成、生长、合并和连接碎片的新化学方法也将促进更快的点击率优化。FBDD也可以受益于增加的兴趣人工智能在该研究中，利用大型数据集来预测片段的关键属性及其生物活性，甚至创建虚拟片段，可能会加速药物发现。