宿主细胞蛋白分析:从过程到进展到未来

生物制药极大地改善了影响数百万患者生命的多种疾病的治疗结果。重组胰岛素是一种拯救糖尿病患者生命的治疗方法。抗体检查点抑制剂靶向抑制细胞表面标志物，释放免疫系统对抗癌症的力量，提高患者生存率。最近，在COVID-19大流行期间，针对SARS-CoV-2刺突蛋白的casirivimab和imdevimab的单克隆抗体(mAb)鸡尾酒降低了住院率和增加生存SARS-CoV-2感染患者。生物制药已证明的有效性刺激了临床前和临床开发管道的增加，导致许多批准在美国毒品市场．自20世纪90年代初以来，美国和/或欧洲生物制药批准的数量从平均水平上升到每年4个至2018年32个，增长了8倍。此外，在过去十年中，它们在药物批准总数中的份额翻了一番。

这个过程

随着生物制药的兴起，人们对生物制药的兴趣和研究也越来越多生产过程．事实上，生物制药制造的进步在一定程度上促进了产品进入药物市场的过程。

生物制药，简称生物制剂，是用活的生物体制造的。它们跨越蛋白质，比如单克隆抗体，现在主导市场到核酸、病毒载体和活细胞，如生物工程嵌合抗原受体T (CAR - T细胞)。单克隆抗体可以通过多种不同的方法制造，如宿主细胞培养中的重组蛋白技术。“在重组技术中，宿主细胞被指示过度表达所需的单抗，”教授解释说亚伯拉罕·伦霍夫他是特拉华大学化学工程教授艾伦·p·科尔伯恩生产过程．“一旦它表达到所需的水平，单抗就会通过多步骤过程从宿主细胞中纯化出来。通常，这从捕获蛋白色谱步骤开始，然后是病毒灭活步骤和一个或多个抛光色谱步骤，依次细化纯化过程。最后，过滤和超滤去除任何残留颗粒。每一个连续的步骤都会增加所需蛋白质产品的纯度。”

尽管经过精心设计和开发的多步净化过程，杂质仍然会污染最终的生物制品。“宿主细胞蛋白质是一种主要的杂质，不幸的是，它可以进入最终的单抗产品，”Lenhoff解释说。“宿主细胞蛋白质的产生是因为宿主细胞除了所需的单抗外，还制造了自己的蛋白质。他们可以选择相互作用或共同洗脱与单抗产品在难度上有所不同消除它们，使得净化过程充满挑战。这些宿主细胞蛋白是有问题的，因为它们对患者是危险的，并降低了单抗治疗本身的质量。”

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宿主细胞蛋白质的问题

宿主细胞蛋白质可能是免疫原性并引起病人的不良反应。宿主细胞蛋白酶可以消化mAb产物，降低其治疗效果。宿主细胞脂肪酶和水解酶可以消化聚山梨醇酯添加赋形剂以稳定单抗，诱导产物聚集和降解。

“显然，宿主细胞蛋白质杂质必须尽可能地消除，”Lenhoff继续说。“在制造过程早期制定的质量控制协议，在单抗纯化过程中监测宿主细胞蛋白水平。ELISA已经是实施最广泛的方法，要么使用经过验证的商业试剂盒，要么像一些公司所做的那样，使用专门开发的检测方法。”越来越多的高通量方法，如液相色谱质谱(LC-MS)-蛋白质组学方法正交ELISA -用于宿主细胞蛋白的鉴定。“LC-MS正变得越来越普遍，是目前宿主细胞蛋白质分析领域的最先进技术，”Lenhoff谈到这项技术时说。与ELISA只量化单抗产品中总宿主细胞蛋白水平不同，LC-MS可以识别特定的宿主细胞蛋白，具有更好的覆盖范围。这是很重要的，也是LC-MS的一大好处，因为宿主细胞蛋白质对患者或抗体产品的稳定性的损害并不完全相同。使用LC-MS可以帮助识别纯化过程何时没有消除这些特别有问题的物种。”

研究进展

虽然LC-MS分析现在可以识别单抗产品中的宿主细胞蛋白，但它并没有解决如何消除它们。斯特凡诺我北卡罗莱纳州立大学化学与生物分子工程系的教授，正在解决这个具有挑战性的问题。“早期的生物制药实践认证单抗批次，如果残留宿主细胞蛋白滴度低于100ppm。然而，即使单抗批次具有可接受的总杂质水平，最近应用先进的分析技术，如蛋白质组学质研究表明，它们仍可能含有不可接受的所谓高风险宿主细胞蛋白杂质。”

高风险宿主细胞蛋白或对患者构成直接威胁，例如毒性或免疫原性，或可降解抗体或赋形剂，降低疗效。越来越多的文献表明，商用色谱树脂难以去除特定的“持久性”或“有问题的高风险宿主细胞蛋白，无论是在过程基础上还是在产物基础上。这些持久的高风险宿主细胞蛋白最终可以被清除，但通常需要添加专用的色谱步骤，这需要费力地优化纯化过程。“这个冗长的过程可能会导致工艺批准和临床试验的延误。此外，纯化过程越复杂，越容易失败，导致无意中宿主细胞蛋白污染和潜在的单抗批次召回，”Menegatti解释说。“此外，它对目前单抗纯化技术的稳健性和效率提出了质疑，因此也对其对产品等待时间和患者成本的影响提出了质疑。”

现在的问题是如何简化和加快持久性高风险宿主细胞蛋白的去除。为了实现这一目标，梅内加蒂和他的团队开发了用于目标宿主细胞蛋白质捕获．“这个概念很简单，但代表了思维模式的转变。在目前的纯化程序中，色谱吸附剂结合单抗和宿主细胞蛋白质“流动”，以间接的方式提供产品纯度。相比之下，我们的方法使用吸附剂，当单抗“流过”时，吸附宿主细胞蛋白质本身，从而以直接的方式积极净化。从本质上讲，我们的方法将宿主细胞蛋白的去除与单抗产品的捕获分离开来，”Menegatti解释道。粘合剂是通过竞争性荧光选择的屏幕荷兰国际集团(ing)在单抗和整个宿主细胞蛋白谱存在的情况下进行。最选择性地捕获宿主细胞蛋白质的粘合剂，同时与单抗相互作用最小，用于生成吸附剂。

Menegatti解释说:“此外，粘合剂的高容量和选择性有助于纯化过程在‘连续加载’模式下进行，纯化的单抗产品不间断流动。”新的吸附剂降低了全球宿主细胞蛋白水平，除了高风险物种，如脂肪酶，组织蛋白酶和组蛋白。“我们预计这种方法将提高过程的灵活性和稳健性，并通过有效清除所有宿主细胞蛋白质，包括高风险物种，降低风险。”

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未来

目前，生物制剂大多是批量生产的，但人们一致认为，工业生物制造必须转向连续操作．“这本质上需要持续工作的净化技术主要材料模式，更快，更紧凑，需要更少的水流。因此，我们预计纯化单克隆抗体和消除宿主细胞蛋白的技术将在主要材料当被问及宿主细胞蛋白质分析的未来时，Menegatti说:“这将是这方面的游戏规则改变者，并有助于实现持续的生物制造。”

生物制药行业的另一个趋势是药物形态。单克隆抗体已经主导了生物制药领域;然而，这种情况正在发生变化基因疗法随着最近几项备受瞩目的监管批准，该公司也走到了前列。

生物制造和宿主细胞蛋白分析的进步帮助单抗药物从临床开发管道进入市场。预计它们还将推动下一代生物制剂的发展，如基因疗法。“重要的是，促进宿主细胞蛋白分析的多功能方法，如基因治疗和细胞治疗，将得到极大的关注，”Menegatti总结道。病毒载体是最有前途的一类，也是目前学术界和工业界研究最多的一类。病毒载体是在细胞培养中产生的，因此，就像单克隆抗体的产生一样，需要监测和去除宿主细胞的蛋白质。”