纳米孔技术为科学研究提供了一种廉价、方便的DNA测序方法。它的紧凑特性也意味着测序不再局限于实验室，应用范围从偏远地区到打击野生动物犯罪甚至在太空中．现在有了突破性的研究格罗宁根大学在美国，隐藏在蛋白质中的秘密也在纳米孔的帮助下被揭示出来。我们采访了格罗宁根大学化学生物学小组负责人Giovanni Maglia教授(GM)进步他和他的团队一直在做。
你是如何开始从事这个研究领域的?
通用汽车:当我在牛津大学做博士后研究时，我接触到了生物纳米孔。那时，我正在做一个用纳米孔进行DNA测序的项目。在我工作的四年半时间里，我们在这个领域取得了很多进展。从纳米孔的离子电流中获得如此多的信息，以及如何研究单个分子，这对我来说是非常神奇的。它们真的是非常有前途的工具，因为它们可以被整合到便携式设备中，而且仍然只观察单分子水平。
当我在牛津大学完成我的职位后，我在比利时鲁汶大学建立了自己的实验室，在那里我开始使用生物纳米孔研究蛋白质。我转向研究蛋白质，因为当我离开时，很明显，DNA领域的大多数进展已经完成，或即将完成，一家公司带着大量资源进入该领域。所以，我觉得DNA测序已经是一个成熟的领域了。
在开发这项技术时，你们必须克服的主要障碍是什么?
通用汽车:蛋白质与DNA不同，将DNA测序转化为蛋白质测序并不简单。我们对DNA测序的了解是，你需要拉伸孔内的DNA，这样你就可以接触到不同的碱基。而且，很明显，你需要一个纳米机器，可以一个碱基一个碱基地棘轮DNA，但这两件事在蛋白质上都不可能，或者至少不明显怎么做。所以我开始研究另一个方面，那就是利用更大的生物孔，试图研究折叠的蛋白质，而不是展开和测序的蛋白质。
与此同时，我们发现了一个叫做FraC的不同孔隙，它看起来非常适合蛋白质测序。该晶体结构于2015年发表。
对于DNA测序，你一次可以读取大约五个碱基，但是在孔内进行非常精确的DNA运动，由聚合酶或解旋酶促进，它们可以非常精确地逐个碱基断裂DNA，允许你摆脱由多个碱基产生的信号。此外，如果不考虑修饰，DNA中只有四个碱基，因此单残基识别在单单位分辨率下本质上更容易。
真正的挑战是蛋白质有20个氨基酸，所以本质上你会有太多的氨基酸在读取区，使信号非常复杂。所以，你真的需要一个小孔来允许更窄的识别。
然而，使用FraC技术时，却遇到了不少挑战，因为为了组装纳米孔，你需要一种特殊的脂质成分，而脂质的表达水平非常低，等等。然而，我们设法克服了这些问题，并在2016年展示了DNA，因为最初它更容易，我们可以使用这个孔来对聚合物进行测序。
然后我们说，好吧，现在我们有了一个孔，让我们看看在蛋白质测序领域我们能做什么。我们对蛋白质和折叠蛋白质的大孔有一些了解，所以我们开始研究研究蛋白质时，小孔大小的限制是什么。
所以，我们现在有两种方法来识别蛋白质，一种是我刚才描述的测序，另一种是通过纳米孔电流来识别蛋白质本身，不管它是展开并通过孔运输，还是折叠，部分折叠，或者只是在孔内而不是在孔中移动。这两种方法非常不同，它们需要不同的孔隙，提出不同的挑战。
用纳米孔识别蛋白质的挑战在于蛋白质组中大约有25000个蛋白质以及这些蛋白质的所有修饰。因此，有效地，为了能够识别一种蛋白质，每个蛋白质都必须有一个单独的电流特征，这对于我们的纳米孔带宽来说是很困难的。25000个单独的信号是相当大的挑战!
因此，为了识别一种蛋白质，我们认为我们需要有一个预纯化步骤，在这个步骤中，你分离出一组你想要研究的蛋白质。你可以用抗体来做，或者简单地用大小，或者你可以用分子的化学性质。在你缩小了这数千种蛋白质的范围后，你就可以用纳米孔来识别它们了。
对于用纳米孔进行蛋白质测序，你需要展开蛋白质，以恒定的电位和恒定的速度将其穿过纳米孔，这是两个主要的挑战。
所以，你可以看到，蛋白质鉴定比蛋白质测序更容易一些，你只需要识别一组蛋白质，非常相似的蛋白质之间的区别。然而，在蛋白质测序中，你实际上需要控制单个分子的纳米级，以及未折叠多肽在纳米孔中的运输。
KS:你如何看待你正在开发的技术与更传统的观察蛋白质和蛋白质测序的方法相比?
通用汽车:蛋白质测序现在是通过串联质谱法来完成的，你只需要取一个蛋白质，把它切成碎片，然后读取每个不同片段的质量。质谱法在过去的一百多年里一直在使用，所以它工作得很好，测量的准确性也非常惊人。你可以读取分子质量的一小部分，所以它真的很好，但同时，它使用了非常复杂和昂贵的机器，而且很难使它便携。
为了让它更便携，还有很多工作要做，只是让它更小，但你真的需要使用真空，你需要有强大的磁铁。如果你与该领域的专家交谈，他们会说，让它变得更加便携将是极其困难的。朝着这个方向正在努力，但这些努力有多好还有待观察。
所以，一方面，它们非常精确，工作得非常好。另一方面，它们非常昂贵，而且不太方便携带。它们的另一个问题是，它们只能读取质量或电荷。有些肽具有相同的质量，最著名的例子是异亮氨酸和亮氨酸，你无法真正区分它们。所以，我们用纳米孔解决的问题是，如果你可以用纳米孔给蛋白质测序——只是给它们测序——那么它将是一种每个人都能用的便携式设备，而且非常便宜。它还可以做质谱仪做不到的事情。例如，因为它作用于单个分子，它可以区分具有相同质量的多肽。
纳米孔蛋白质测序主要解决两个问题，一是检测低丰度蛋白质。由于质谱现在是一种组合技术，你只能看到样本中更丰富的蛋白质。因此，你需要净化和浓缩等，但这有时是困难的，因为有时你的生物样本中蛋白质的含量非常低。纳米孔本身是单分子，本质上具有单分子的灵敏度。当然，为了能够真正观察和分析，你需要捕获分子，这是一个挑战。如果你在一毫升血液中有一个分子，那么这个分子被你的纳米孔捕获的机会几乎为零。然而，你能做的是将分子驱动到纳米孔中。有人研究了如何浓缩分子，比如在膜周围，这可以极大地提高分析物的浓度。或者你可以把它吸引到纳米孔的口。例如，通过将粘合剂附着在纳米孔本身，他们可以将分子漏斗穿过纳米孔。
第二件事是你可以研究翻译后修饰。我们血液中的许多蛋白质(如果不是大部分的话)似乎都经过了化学修饰。它们是我们在课本上学习的蛋白质，但一旦它们看到细胞表面就会发生各种各样的反应，很多氨基酸会被化学修饰。
很多修饰可能并不重要，但至少有一些修饰对蛋白质的功能，以及蛋白质之间的相互作用等非常重要。在组装技术中很难研究这种修饰过程，因为如果修饰是异构的，就不容易看到它。如果所有的蛋白质都被修饰了，或者大量的蛋白质被修饰了，你可以看到。然而，如果修饰可以以许多不同的方式发生，糖基化是一个著名的例子，每个分子都与其他分子略有不同，因此需要单分子技术来研究它。目前，单分子测序技术还不存在。所以，开发第一个单分子技术，让你真正看到分子是怎样的，这是重要的一步。
Giovanni Maglia教授接受了科技网络科学作家Karen Steward博士的采访。188金宝搏备用
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