低温电子显微镜(低温电子显微镜)是一个不可或缺的技术结构生物学家探索的基本材料,使我们的细胞。但这并非总是如此;只有通过最近低温电子显微镜技术的发展有其真正的潜力被意识到。
布丽姬特卡拉格,兼职教授哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理学和联合西蒙斯电子显微镜中心在纽约结构生物学中心,知道如何推进低温电子显微镜技术。她的工作自动化的低温电子显微镜和其他电子显微镜技术帮助转变从一个不精确的低温电子显微镜,煞费苦心地缓慢的方法可以直接与其他蛋白质分析技术。
我们采访了布里奇特发现自动化如何增强低温电子显微镜,仍有改进的地方,和一个完全自动化的未来低温电子显微镜可能意味着研究人员。
Ruairi Mackenzie (RM):为什么低温电子显微镜结构生物学家如此有用吗?
布丽姬特卡拉格(BC):结构生物学本身是一个非常有用的生物方法。与结构生物学我们希望理解分子机器的结构;我们身体的基本机械,有成千上万的这些机器完成所有的工作在一个细胞。所以结构生物学本身是必不可少的理解这些机器是如何工作的,它们的功能是什么,以及如何修复它们时出错。年复一年x射线晶体学和某种程度上主导的核磁共振结构生物学技术用于解决蛋白质的结构。
低温电子显微镜流行大约五六年前,没有它没有了几十年,但它已被作为一个困扰低分辨率的技术。换句话说,你可以看到这些机器只是作为一个模糊的“气泡”,你不能看到每个原子的机器,因此你不能理解它如何工作。低温电子显微镜经历了一个“解决革命”大约五六年前,这是部分完成的出现一个全新的相机,可以直接检测电子而不是光子。
其他相机有一个光子探测器,如一个在你的手机,但透射电子显微镜(显微镜)产生电子,现在我们有这个相机可以检测电子直接提高了分辨率。甚至比,需要电影而不是单一的框架。就像你的iPhone现在能做。这些摄像头,在某种程度上,给我们这些优势,所以低温电子显微镜从附近的一个“blobbology”方法原子分辨率方法。低温电子显微镜对晶体学的优点是,你不需要结晶样本;有时事情会花费很长的时间结晶,有时他们从不结晶。
有很多很多结构被低温电子显微镜解决现在,每天都有很多。这些目标晶体学家们曾多年!他们美丽的干净的蛋白质被困在他们的冰箱,因为他们不会结晶,现在,他们会在低温电子显微镜和迅速解决这些结构。
公元前的一个挑战是需要多长时间生产这些结构。在某些方面看起来非常快,我们需要做的是收集成千上万的个人图片,或电影,从显微镜,然后我们把结构的图像,然后我们处理一大堆的计算机算法。在获取图像的步骤我们直到最近每天约有1000张图片这些显微镜。当你需要成千上万的这些图像,这意味着你花天,天在显微镜下一个项目。这是长得出奇的在某些方面。在同步加速器(x射线断层扫描机器)这些天,你可以得到数据集在几秒或几分钟,所以你可以分析每天成百上千的结构。
低温电子显微镜背后还有很长的路,但我们希望它会迎头赶上。我们希望更好更快的相机和新方法获得更快的图像,我们可以看到一个改善大约十倍这些乐器的吞吐量。我们想自动化和提高显微镜的技术来获得更多的图像,然后我们想自动化的处理这些图像到三维结构。当你坐在你宝贵的显微镜样品装在里面,你应该看到的3 d地图样本,知道当你有足够的数据。然后,我可以停止收集和进入我的下一个非常重要的珍贵的样本。现在,我们没有这样的实时反馈和大量的自动化是必要的。人们仍然坐在显微镜和做出决定;这只是通常早上几个小时,然后他们让竞选那天其余的时间。
但我认为我们很快就会需要自动修改样品,以便许多可以通过一天流;我们会学习算法,知道如何设置样例集合,然后移动到下一个已经获得足够的数据时。目前,这不是这样的一个瓶颈,因为就像我说的,我们收集了一天或两天,所以我花了几个小时设置不是瓶颈,但如果我们只收集每个样本一小时,现在你改变样品每小时,所以你也有自动化这一步。
在开发一个自动管道,我总是认为它是只处理下一个瓶颈。当你一旦你解决一个管道,管道的其他点立即成为瓶颈。我们走得越来越快,我们必须解决不同的点沿着这管道。
RM:工作流被证明是最困难的一步自动化?
公元前:大部分的分析管道完全自动化。什么不是自动化是制作标本的最低温电子显微镜的一切发达国家在1980年代早期以来已有所改善,但一件事没有改变很多的样品放在第一位。低温电子显微镜你需要你的样品,基本上一个翻滚在本体溶液分子机器,减少到一个薄膜,否则电子不能通过它。一旦它就变成了一个薄膜flash冻结;把它变成一个陶瓷(玻璃),固体层很像水除了冻结。这一过程是更加困难比我们想象的大约十年前。这个样本的时候减少薄膜接触表面的气水界面。蛋白质有时很不开心在这个接口,很多人可以在这些情况下表现不好。许多团体现在开始努力思考该做什么。
在我们的实验室,我们发展的方法,我们喷样例使用压电分配器到网格,类似于你在你的喷墨打印机。我们使用非常微量的样品;优势的样品有时很难生产,我们喷到所谓self-wicking网格,将样本成薄膜迅速传播。我们可以得到薄膜到冰冻的状态下比我们可以使用的方法更快速开发,所以我们能逃脱的一些有害影响气水界面。我们发展这项技术好几年了,现在被商业化,这样别人也可以用它。这种方法的优点是,有时你看到更少的聚合,或少择优取向,或者看到你的蛋白质保存较为完好的状态。我相信会有许多其他方法未来的进展,因为现在每个人都知道这是一个真正的问题,是一个真正的障碍对于一些样品。显然,我们解决了很多结构,所以这不是一个问题,但对于一些东西,这是一个总奇观。
其次,并不是所有人都是伟大的在网格领域传统的方式和新人们可以找到它很困难。它可以带他们几个月好,所以我们也需要自动化这个过程。这台机器这些样本点到self-wicking网格是非常高度自动化,有可能完全自动化网格。
RM:其他低温电子显微镜技术的进步你会强调什么?
公元前:低温电子显微镜有两大分支。一是单粒子,我们看许多类似的粒子分散到一个字段。另一个断层,圣杯是观察细胞内分子机器即解决结构原位。细胞太厚了,进入一个透射电子显微镜,所以我们用一种方法来创建薄区域是使用在扫描电子显微镜聚焦离子束,字面上切一个冷冻细胞薄层,薄层;我认为沃尔夫冈·鲍迈斯特和他的团队创造了这个词“windows切成细胞”。你使用这个聚焦离子束刀砍下一根窗口然后你把窗口在TEM。在这一过程被称为断层扫描,取倾斜薄地区的观点然后你可以重建的三维视图。
从这些3 d x线断层照片然后你必须找到您感兴趣的分子,现在在一个非常混乱和复杂的细胞环境,提取它们作为单个粒子,然后使用类似的平均技术为我们做单粒子。这听起来很复杂,它是,它很难。自动化这个过程只是开始发生,但是我认为我们需要一个非常高水平的自动化如果这方法是要去一个大型社区和被广泛使用。
RM:一旦我们克服这些挑战,如何研究方法低温电子显微镜不同?
公元前:然后它将更像晶体学的过程。我认为在我们的一个会议上有人曾经说未来属于生物化学家。我认为未来属于生物化学家和细胞生物学家,也许那里的神经科学家,因为显微镜将变得越来越自动化,只会成为一种工具就像x射线晶体学是现在。技术是高度自动化,你不必成为一个专家。你必须很好的蛋白质和好的晶体但然后你船在批量同步加速器。有些好,有些坏,你不必太过担心,因为它都是自动化的,你找到好的数据很快和你完成。所以,我认为低温电子显微镜将走向,它会成为一个技术,可用于任何人,任何生物,细胞生物学家,神经学家谁想使用它。我认为我们有点远离细胞生物学和神经科学的理由,但不是迄今为止对结构生物学。我认为低温电子显微镜是会得到高度自动化在未来五年多了。
RM:资金帮助将使所有这一切成为可能?
公元前:没有资金没有发生这种情况。资金技术发展非常困难。很少有媒体这样做,但美国国立卫生研究院通过P41计划一直很慷慨地提供资金来开发新技术。我们整个中心也是西蒙基金会的慷慨资助,我们非常感激,因为没有支持,这一切都将会发生的事情,我们都将很长的路离我们现在的位置。我应该现在还提到,美国国立卫生研究院共同基金也资助的三个国家中心提供访问和培训全国各地低温电子显微镜的,任何人都可以使用这些免费申请。
你可以找到更多关于这些国家中心为低温电子显微镜提供访问和培训使用下面的链接:
