从基因疗法中去除宿主细胞蛋白质污染的一种更聪明的方法
什么是宿主细胞蛋白质?为什么它们对基因治疗很重要?
当基因疗法被创造出来时，它们是用来自细胞系的细胞制造的。这些细胞在很大程度上起到了生物工厂的作用，生产构成最终基因治疗产品一部分的蛋白质，这些蛋白质需要从细胞中提取和纯化。在这个过程中，杂质和污染物会发生，需要去除。污染的一个关键来源是宿主细胞产生的其他蛋白质。这些宿主细胞蛋白(HCPs)非常重要，因为它们中的任何一种都可能具有生物活性，即使浓度非常低。HCPs可能会干扰基因治疗的功能，影响疗效和安全性。即使HCP本身没有生物活性，它也可能引发免疫反应，导致患者耐药。因此，HCPs是监管机构的关键质量属性(CQA)。检测、监测和控制HCPs对于保证基因治疗产品的质量、疗效和安全性至关重要。
所有生物制品都是如此。然而，与传统生物疗法相比，基因治疗产品在生物制造方面更加复杂。这一过程引入了更多潜在污染蛋白质的来源，这意味着从最终产品中清除这些蛋白质可能会更加复杂和昂贵。
基因治疗很复杂
“典型的”生物制剂是通过在单细胞系中只表达一种蛋白质并进行纯化而制成的。对于基因治疗产品，病毒通常需要纳入最终产品。将这些病毒添加到宿主细胞中会引入许多新的蛋白质，这些蛋白质可以与最终的基因治疗产品共同纯化。出于与HCPs相同的原因，这些不需要的病毒蛋白也需要从最终产品中检测、监测和清除。
此外，进一步的蛋白质通常添加到生长介质中，以帮助保持细胞健康和提高其功能。这些蛋白质往往来自不同种类的宿主细胞。虽然宿主细胞通常来自人类或其他哺乳动物的表达系统，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，但添加到细胞培养物中的蛋白质通常有意来自其他物种，如用于牛血清白蛋白的奶牛或用于苯联酶的细菌。最终，基因疗法开发者需要检查来自几个非常不同物种的污染蛋白。酶联免疫吸附测定(elisa)由于其快速、灵敏和易于使用，是生物制药分析HCP的传统方法。然而，目前还没有一种商业ELISA能够在单个样品中检测这种异质混合的HCPs。
标准生物制剂和基因疗法之间的另一个区别是，当使用人类细胞系时，人类HCPs的免疫原性不强，导致elisa的覆盖率往往很低。这意味着ELISA可能无法检测出样本中相当大比例的HCPs。因此，单独的商业elisa通常不能很好地检测基因治疗产品的HCPs。它们对不同的特定HCPs没有足够的特异性，对微量HCPs没有足够的敏感性，对大范围浓度范围内存在的HCPs没有足够的动态范围。
与传统生物制剂相比，基因疗法的另一个复杂之处在于它们往往具有较短的开发时间。基因疗法大多被监管机构快速审批，因为它们的目标是治疗癌症等严重疾病。如果没有合适的商业elisa，制药公司将不得不开发专门用于其药物和生物制造过程的elisa。这通常需要1.5-2年的时间，但由于时间紧迫，公司根本没有时间开发过程特定的elisa。此外，如果由于最终基因治疗产品的HCP检测和清除不足，或者没有足够的数据来验证用于确认HCP清除的ELISA，基因治疗被推迟获得监管部门的批准，这种挫折可能会阻碍药物开发足够长的时间，让竞争对手首先将他们的基因治疗推向市场。由于基因疗法可能是一次性治愈，第一个进入市场的人实际上可以拥有整个市场。
质谱与SWATH采集满足基因治疗HCP分析需求
为了解决仅使用ELISA检测和分析基因治疗的HCP所遇到的问题，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)正在成为补充ELISA数据的选择方法。这是因为它在检测复杂生物样品中高度异质性的HCPs时提供了必要的特异性、敏感性和动态范围。LC-MS/MS不仅提供了同时测量数千种蛋白质的能力，还可以量化和表征这些蛋白质(见图1)。此外，它适用于广泛的样品，从复杂的生物制剂到各种基因疗法，甚至是基于寡核苷酸的药物等新模式。
这种灵活性和实用性极大地满足了正在开发基因疗法的生物制药公司的需求。开发一种独特的HCP检测和表征方法和工作流程将在各个方面满足特定的需求。1 - 4该方法和工作流程特别适合于基因治疗生物分析，因为它采用了SWATH采集，这是一种数据独立的采集技术，适用于TripleTOF 6600仪器(见图2)。SWATH采集允许从生物样本中所有分析物中全面收集多维数据。5、6这种彻底、精确和可靠的覆盖远远优于商业elisa所实现的覆盖。1 - 4通过使用LC-MS/MS方法，基因治疗开发人员可以确保他们有效地检测产品中存在的所有HCPs。
图2:SWATH(所有理论光谱序列窗口采集)质谱法是一种在与HPLC(高效液相色谱)兼容的时间范围内收集样品中所有前体离子产物离子光谱的方法。为了实现这一目标，整个前驱体离子质量范围被分割成自动或用户自定义的范围。这些离子质量范围中的每一个都作为一个单独的数据包发送，用于CID(碰撞诱导解离)碎片。然后记录随后的复合产物离子谱。对于每一个其他质量范围，该过程都以非常高的速度重复。同样的过程在每一个测量周期重复。它可以对样品中的每一种前体和每一种产物离子进行全面和可量化的测量。5
LC-MS/MS在基因治疗发展的许多方面都至关重要
LC-MS/MS提供的数据比elisa获得的数据更丰富。elisa提供的数字相当随意，LC-MS/MS提供每种HCP的绝对定量。此外，elisa在批次与批次之间经常产生不同的结果，因此不可重复。这对基因疗法的开发者来说是非常令人沮丧的。
相比之下，LC-MS/MS具有很高的重现性。LC-MS/MS可用于多种方式:
- 为流程开发提供信息
- 告知和验证商业elisa试剂盒的选择
- 甚至完全取代elisa
尽管酶联免疫吸附法在成本、方便和目前的法规合规性方面仍然受到青睐，但LC-MS/MS分析可以帮助确定哪种商业酶联免疫吸附法最适合特定项目，也为验证其选择提供了证据。LC-MS/MS也是一个强大的工艺开发工具，因为它具有全面的覆盖范围和测量每种分析物的物理化学性质。有了这些信息，开发人员可以对他们的过滤器和/或缓冲区进行简单的调整，以完全消除HCPs。
用于ELISA验证或HCPs直接分析的MS数据正成为监管机构日益重要的因素。使用SWATH采集意味着收集的数据可以有效地永久保存，随着时间的推移，库和数据库的注释变得越来越好，这可能更有意义。许多大型生物制药公司预测，监管机构要求在其HCP分析中强制使用质谱数据只是时间问题，这就是为什么他们投资于先发制人地将LC-MS/MS纳入其HCP分析和风险管理策略。LC-MS/MS为任何ELISA或其他HCP分析提供了信心和安全性，确保所有HCP在整个药物开发生命周期中都得到充分考虑，从而进一步降低了风险。
共同努力，将新的基因疗法更快、更安全、更便宜地带到诊所
与开发工艺特异性ELISA通常需要1.5-2年的时间相比，LC-MS/MS分析通常只需要6 - 8周就可以对任何生物产品进行优化和建立，从项目开始到收到监管机构验证通知。因此，LC-MS/MS可以极大地加速新型基因疗法的开发、上市批准和商业化生物制造。
Ejvind m æ rtz博士，Alphalyse联合创始人兼首席运营官。他在几家生物技术公司有20多年的工作经验。他的经验包括在研究中开发蛋白质分析方法和蛋白质生物制剂的CMC开发，以及与CMOs/ cro的商业合作。他拥有哈佛商学院的商业管理教育。作为Alphalyse的首席运营官，他推动了客户分析服务的发展和改进。
Todd Stawicki是SCIEX生物制药LC-MS的全球营销经理。他在几家制药和生物制药公司担任研究科学家，并在SCIEX担任LC-MS应用科学家，拥有超过15年的经验。作为一名营销经理，他热衷于为客户提供最创新和最有效的LC-MS方法，以实现他们的科学目标。
引用:
1.王志强，王志强，王志强，等。高效液相色谱-质谱分离HCP的研究。BioPharm国际．2019年6月30日http://www.biopharminternational.com/using-lc-ms-efficient-hcp-clearance(2020年4月访问)。
2.李文杰，李志强，李志强，等。SWATH®LC-MS对单个宿主细胞蛋白的鉴定和绝对定量。https://www.alphalyse.com/wp-content/uploads/2018/11/poster_hcp_id_and_quantification_by_swath.pdf(2020年4月访问)。
3.张志刚，张志刚，张志刚，等。正在开发的疫苗样品的宿主细胞蛋白微流lc高分辨率SWATH-MS分析2016年美国质谱学会年会．海报ID: WP 628。https://sciex.com/Documents/posters/asms2016_628_Wed_Heissel_Neffling.pdf(2020年4月访问)。
4.Carapito C.双数据独立采集方法，使用SWATH®采集-质谱对宿主细胞蛋白(HCP)进行分析，并在生物工艺开发过程中对关键杂质进行绝对定量。按需网络研讨会。SCIEX。https://sciex.com/events/hcp-profiling-quantification-impurities(2020年4月访问)。
5.SCIEX。SWATH收购，确保不遗漏任何内容。https://sciex.com/technology/swath-acquisition(2020年4月访问)。
6.李志强，李志强，李志强，等。改进复合筛分的扫描SWATH®采集方法。https://sciex.com/Documents/posters/asms2018/Technology/354_Monday_Ivosev.pdf(2020年4月访问)。
