MicroCal PEAQ-ITC用于药物发现|莫尔文Panalytical - 188bet金宝搏手机网页,188金宝搏备用

绑定的测量和表征蛋白质和低分了重量配体之间的相互作用是药物发现的根本。最公认的挑战在描述绑定交互(1)需要准确地评估一个大跨度的绑定关联(K_D)和(2)准确等级和描述低分了重量(流明瓦)基于亲和配体,作用机理和能量的交互。

可靠的数据绑定可以解释复杂的蛋白质浓度的活性蛋白质分数或不准确的评估。评估这些数据可以进一步受到固有的不确定性的浓度复合股票。这种不确定性的结果不准确的测量,溶解度有限,或潜在化学异质性等化合物的对映体的存在和同分异构体。

等温滴定量热法(ITC)直接绑定事件措施吸收或释放热量,为学习提供意味着protein-small分子相互作用在溶液中不需要标签或固定。高度敏感的ITC仪器和正确设计实验条件能够占不准确评估蛋白质浓度或不活跃的分数,并占化合物的精确浓度的解决方案。从分析开发和质量控制(QC)铅优化,ITC提高我们对生化数据的理解。正常化的蛋白质或化合物浓度和占蛋白质的不活跃的人群可以改善决策过程,其中一个例子是一个更加谨慎评估贡献绑定向左反应的变化,这是许多一流的药物研究的关键。

本白皮书强调了优势的新ITC instruments-MicroCal PEAQ-ITC和MicroCal PEAQ-ITC自动化系统和MicroCal PEAQ-ITC分析软件。绑定交互的软件可以分析复杂的活性蛋白质材料,不正确的蛋白质浓度,和/或不准确的浓度或异质性复合解决方案。

改进的特别行政区

活性蛋白浓度测定

ITC是利用在早期药物发现,从分析优化工作和二次筛选涉及铅优化的后期。此外,ITC可以用于蛋白质纯化QC一步评估批量变化和冻融稳定性。在早期的应用程序,一个通常测试一组化合物包括的积极控制。定期使用积极的控制配体对蛋白质质量监测提供了手段和建立和确认活性蛋白质浓度在一系列持续的ITC实验。的MicroCal PEAQ-ITC分析软件生成的绑定参数散点图的一系列连续滴定。这样的情节便于检测可能的趋势和帮助识别潜在问题分析设置和试剂质量。

图1展示了一个散点图的N值获得连续的一系列ITC滴定。它显示了一个趋势明显的目标蛋白的结合位点。随着时间的推移逐渐减少N值很可能反映出目标蛋白质的稳定性问题。蛋白质稳定性有限,批次变化和有限的冻融稳定性相关的靶蛋白的共同挑战protein-ligand交互的研究。ITC是有用的数据确定一个很多蛋白质不同明显活动(绑定)相对于以前的很多提供潜在的规范化标准,它是有用的在许多化验运行整个筛选/特征的过程。

图1:产生的n个值散点图MicroCal PEAQ-ITC软件的一系列连续滴定5µM牛碳酸酐酶II (bCAII) 50µM ethoxzolamide磷酸盐(PBS), 25°C。MicroCal ITC自动化系统中的实验(实验)之间的时间间隔为1.5 h。

与活性蛋白的浓度在ITC建立和使用数据分析,剩余的明显的化学计量学中的错误(即非整数值1、2…等)可以分配给正确的配体浓度的测定。

准确的配位体浓度测定

原因有很多,在药物发现并不少见,给出化合物的浓度的解决方案有重大错误。这个不准确直接影响质量的配件返回的绑定参数绑定数据;尤其是向左反应的正确的决心和熵的贡献绑定。在新的MicroCal PEAQ-ITC分析软件,它可以识别和解释化合物的浓度误差最小化任何热力学测量中的错误。

图2给出了散射在化学计量学(N)由ITC的交互与一系列流明瓦击中靶蛋白药物发现和开发项目。这是由客户端使用MicroCal汽车iTC200。N值的范围从0.2到1.8,和不活跃的一小部分蛋白没有联系已经建立了使用上面描述的方法。此外,1:1结合化学计量学预计基于x射线结构化合物的复合物。因此很明显,差异明显的化学计量学是由于不正确的配体浓度的确定。

图2:案例研究(具备此数据)。总结的N值获得一系列流明瓦与目标蛋白质的相互作用,在药物发现和开发项目进行MicroCal汽车iTC200。

这些错误产生的直接影响焓数据ITC使它很难解释热力学的差异每个目标蛋白配体的相互作用。

新MicroCal PEAQ-ITC分析软件可以通过允许占注射器的流明瓦配体的浓度变化而拟合过程中的化学计量值设置为1(这同时可以自动执行许多数据集)。图3显示了焓数据返回,没有这个校正因子。

图3:比较的返回焓数据交互的一系列流明瓦击中一个靶蛋白的药物发现项目,(浅蓝色)和没有(深蓝色)配体浓度的校正。递减的顺序列出了这些化合物亲和力。

很明显,返回焓数据错误时截然不同的配体浓度纳入分析显然会有很大影响的解释特别行政区(结构活性关系)的铅优化研究。

不准确的配体浓度的另一个后果是,实验可能很难分析由于不完整的绑定等温线的性质和可能需要重复。这方面的一个例子如图4所示。

图4:ITC滴定的数据的例子一流明瓦配体蛋白配体浓度的显著的误差。原始ITC数据(上部面板)和集成数据安装在One-set-of-sites交互模型(较低的面板)。适合进行(一)没有和(B)占化合物浓度误差。较低的面板的insets包含返回的拟合参数分析软件。

的MicroCal PEAQ-ITC分析软件可以适应这些不完整的绑定等温线通过使用一个常数抵消,代表控制加热,在拟合的过程。结合控制偏移量和不同配体的浓度在拟合过程中,此前“unfittable”或困难的数据集可以自动分析非主观性的方式。为应用程序在很多情况下这就足够了,至少,可以用来建立正确的化合物浓度的股票。在这个例子中,配体浓度最初估计126µM 200µM但被发现。这个错误有一个巨大的影响在焓熵(ΔH)和(-TΔS)改变了-2.8千卡/摩尔和2.28千卡/摩尔,分别,而明显的K_D改变从241纳米到122纳米。这些差异突出的价值的新特性分析软件,它将带来的好处健壮的数据解释。

同时亲和力测定同分异构体和对映体

在后期药物发现,相当数量的化合物是合成对映体的混合物或同分异构体。在很多情况下,化合物的混合物可以通过高效液相色谱法(HPLC)分离和一个或多个异构体可以单独测试。然而在某些情况下,特别是那些涉及到对映体的混合物,可以分离困难和耗时的,在这些情况下,混合物必须直接测试。生化检测,主要提供信息紧密绑定组件的混合物。相比之下,ITC可以提供绑定信息强和弱粘结剂同时在一个单一的实验。

两相的绑定等温线图5中代表一个例子如何ITC数据可能会寻找注入一个对映体配体混合物倒入一个目标蛋白质在细胞中。同样,两相的等温线时观察到的高亲和力配体是故意与弱混合配体作为一种竞争实验来确定K_D直接测量的范围之外。这不同于典型的方法将紧密结合配体注入目标和疲软的抑制剂,但优势抑制剂可以同时得到解决和无先验知识的交互参数的弱相互作用。

图5:MicroCal iTC200滴定的数据对映体化合物为目标蛋白(具备此数据)。绑定等温线显然是两相的;然而,分析数据与起源ITC数据分析并不简单。

演示的效用MicroCal PEAQ-ITC分析软件为分析复杂的绑定等温线我们进行实验与混合配体(ethoxzolamide (EZA)和呋喃苯胺酸(毛皮))在注射器注入目标蛋白质(牛碳酸酐酶II, bCAII)细胞。数据如图6所示,代表两相的等温线数据的类型,预计对映体的混合物或“注射器”竞争实验。

图6:原始和归一化热块的滴定1:1的混合物EZA bCAII和毛皮。160µM总浓度的滴定进行化合物的注射器和10µM concentation bCAII的细胞(左)或100µM复合混合物的浓度和5µM concentation bCAII的细胞(右)。18×2µl注入了和PBS缓冲,2 v / v % DMSO 25°C。

这些实验证明的水平分辨率,可以通过使用MicroCal PEAQ-ITC和潜在的定量描述绑定的混合物。复杂ITC的拟合数据,特别是这些竞争的拟合实验,取得了比较简单的MicroCal PEAQ-ITC软件比以前分析软件可以在早期的模型。时输入的初始猜测到拟合软件始终是一个良好的开端,目前的软件包含更合适的数值边界增加成功的可能性和最小化风险的拟合过程陷入局部最小值。拟合这些数据也受益于结合单纯形拟合和Marquardt-Levenberg拟合方法在软件可用。更具体地说,使用单纯形方法开始并最终确定使用Marquardt-Levenberg拟合的算法。使用这种方法获得的热力学参数与两个站点的模型和配位体在细胞的设置进行了总结在表1所示。