使用新的MicroCal PEAQ-ITC系统测量和表征广泛的蛋白质- lmw化合物相互作用

蛋白质和低分子量配体之间的结合相互作用的测量和表征是学术研究和药物发现的焦点。等温滴定量热法(ITC)直接测量结合事件中释放或吸收的热量，为研究蛋白质-小分子在溶液中的相互作用提供了手段，而不需要标记或固定。重要的是，ITC经常被用来描述新配体结合的熵和焓贡献的差异。

与绑定相互作用的测量和描述相关的挑战之一是需要解决的广泛的亲和范围。结合亲和值(测量为解离平衡常数，K_D)在典型的药物发现项目中，与靶蛋白结合的小化合物的浓度范围可以从低毫摩尔到亚纳摩尔。依赖于所研究的生化系统(受体、转运蛋白、酶等)，同样广泛的亲和范围与学术研究相关。

高灵敏度的ITC仪器和合理设计的实验极大地简化了结合相互作用的表征。我们的新ITC系统MicroCal PEAQ-ITC旨在提高信号稳定性、混合和信噪比特性(图1)。这些变化，以及集成在易于使用的数据分析软件中的先进实验设计功能，有助于优化具有挑战性的相互作用研究的实验。本白皮书强调了新的MicroCal PEAQ-ITC仪器和软件的有益特点，用于通过直接和竞争滴定分析结合相互作用。

提高数据质量的MicroCal PEAQ-ITC仪器

用牛碳酸酐酶II滴定乙酰唑胺，以比较新的MicroCal peq - itc与其前身MicroCal iTC200。来自两组实验的数据表明，MicroCal peiq - itc的短期噪声降低了约5倍(图1)。当样品很珍贵或需要低浓度来准确定量低纳摩尔亲和相互作用时，这些数据质量的改善提高了分析低热量数据的可信度。

图1:使用MicroCal peq -ITC(上)和MicroCal iTC200(下)系统将20µM乙酰唑胺(ACZA)滴定到2µM牛碳酸酐酶II (bCAII)的原始ITC数据叠加。

广泛的绑定亲和力

在这里，我们通过使用一些抑制剂对牛碳酸酐酶II (bCAII)和人碳酸酐酶I (hCAI)进行滴定，证明了新的PEAQ MicroCal ITC仪器在描述结合相互作用方面的适用性。这些例子涵盖了K的广泛范围_D(0。320毫米至~ 1纳米)和焓(~-6至~-15千卡/摩尔)。典型数据集如图2所示，结果汇总在表1中。

图2:200µM速尿用2µL注射剂滴定20µM bCAII(左)，25µM乙氧唑胺用1µL注射剂滴定2.5µM bCAII(右)的原始(上)和综合热图(下)。

表1。总结了用一系列抑制剂滴定hCAI和bCAII (n=3)的结果。配体按以下浓度滴定成靶蛋白:2.5 mM磺胺加入35µM hCAI, 200µM呋塞米加入20µM bCAII, 50µM乙酰唑胺加入5µM bCAII, 50µM乙氧唑胺加入5µM hCAI, 25µM乙氧唑胺加入2.5µM bCAII。实验在PBS缓冲液中进行，浓度为2% v/v，温度为25℃。

蛋白质	化合物,n = 3	N(网站)	误差(N)， %	KD(M)	pKD	错误(KD), %	ΔH(千卡/摩尔)	error (ΔH)， %
卫生保健相关感染	Sulfanil - 酰胺	1．0	固定	3.2 e-04	3．5	16	-5.9	15
	Ethoxzol - 酰胺	1．0	1．0	1.9 e-08	7.7	7	-8.7	1
bCAII	呋喃苯胺酸	1．0	1.7	3.6 e-07	6.4	18	-6.3	3.
	Acetazol - 酰胺	0.9	0.6	1.8 e-08	7.7	3.	-12.6	3.
	Ethoxzol - 酰胺	0.9	0.3	4.4平台以及	9.4	95	-14.4	3.
	Ethoxzol - amide Vinj=1 uL	1．0	1．0	1.3 e-09	8.8	76	-15.1	1

所有的相互作用都是使用注入18,2 μ L配体到细胞中的蛋白质溶液的标准方案进行研究的。对于亲和度为18 nM或更弱的相互作用，K_D都低于20%，有些甚至远低于10%。除了磺胺:hCAI相互作用时N固定，反应焓变化15%外，反应焓和化学计量数据的误差均在3%以内。这些测量结果表明，即使蛋白质浓度低至2.5微摩尔，使用该仪器也可以获得高度可重复的数据。

可以预见，最紧密的粘结剂乙氧唑胺的K值变化最大_D由于c值*较高，结合等温线上只有两个实验数据点表示的过渡范围不太明确(表1)。即便如此，94%的误差对于这些紧密的相互作用通常是可以接受的，并提供了对数据的一定程度的信心。

然而，由于新型MicroCal PEAQ-ITC仪器的移液器的低信噪比和良好的精度(图1)，可以采用更小的1 μ l注射体积。使用这种方法，可以用更多的数据点填充过渡区域(图2)，从而提高亲和性数据的质量。这在K值误差的小但可测量的减小中得到了证明_D到76%，进一步提高了对数据的信心。图3显示了pK方面的这些数据_D这可能是比较亲缘关系数据更合适的方法。

* C- value定义为C = N*[Cell]/KD，其中[Cell]为大分子在细胞中的摩尔浓度，KD为平衡解离常数，N为大分子上的结合位点数。

图3:K_D用新的MicroCal PEAQ-ITC仪器和分析软件获得的hCAI(红色)和bCAII(蓝色)系列LMW抑制剂的值。所有数据都是用18 × 2 μ l的配体注射到蛋白质中收集的。另外，K_D用38 × 1 μ l注射(第一次注射0.4 μ l)滴定得到的值也报道了bCAII与乙氧唑胺(EZA)的相互作用。为了便于比较，K_D图上的值用pK表示_D．误差条表示pK单位的误差_D(K的%的误差_D简称:EZA -乙氧唑酰胺、fur -速脲酰胺、acza -乙酰唑酰胺、sulfa -磺胺、bCAII -牛碳酸酐酶II和hCAI -人碳酸酐酶I。

竞争滴定法作为一种定量低纳摩尔结合的技术

从本白皮书中已经显示的数据可以清楚地看出，K_D感情越紧密，决心就越坚定。在这种情况下可以采用竞争滴定法。

在竞争实验中，强结合配体被注入到目标蛋白中，存在较弱的竞争性化合物。在缺乏较弱的抑制剂的情况下，ITC滴定在过渡区域没有足够数量的数据点来拟合一个独特的结合等温线。如图4A所示，其中200 μ M乙氧唑胺以2 μ L等分液注入20 μ M bcai中。通过使用MicroCal PEAQ-ITC提供的竞赛实验设计工具(见图5)，可以确定实验条件，以确保在过渡范围内有足够数量的数据点，并具有足够高的热值，以实现良好的信噪比。选择将100 μ M速尿添加到蛋白质溶液中。所得滴定结果如图4B所示。

图4:(A) 200 μ M EZA直接滴定成20 μ M bCAII和(B) 200 μ M EZA竞争滴定成20 μ M bCAII和100 μ M FUR的原始和集成ITC数据。

图5:MicroCal PEAQ-ITC中的竞赛实验设计工具

表2:将25µM EZA直接滴定成2.5µM bCA II，并将200µM EZA竞争滴定成预混100µM FUR的20µM bCA II, Vinj=2µL，得到bCA II与EZA相互作用的结合参数。

实验装置	KD(nM)	错误(KD), %	ΔH(千卡每摩尔)	错误(DH), %
直接滴定法	0.4	95	-14.4	3.
竞争滴定	0.4	40	-13.9	6

从竞争滴定法得到的紧密结合剂的结合参数与直接滴定法得到的数据非常吻合(表2)。这个案例研究证明了竞争实验和设计工具在确定紧密结合相互作用方面的实用性。

总结与结论

这里的结果表明，新的Microcal PEAQ-ITC系统可以获得高质量的数据。它具有高信噪比，可用于测量广泛的亲和范围。这里测量的最紧密的例子，即EZA和bCAII之间的相互作用，具有1 nM的亲和性，只有两倍的变异性。这对于任何测量纳摩尔亲和度的技术都具有非凡的可重复性。这里测量的微摩尔相互作用的误差只有大约20%或更好。这些结果表明K的测定具有良好的重复性_D．

竞争实验中，蛋白质与一种配体预混合，并与另一种配体滴定，可用于将ITC可用于的亲和范围扩展到高皮摩尔范围。这种方法的一个缺点是实验设计的复杂性。MicroCal PEAQ-ITC分析软件有一个模拟工具，使设计和分析非常简单。

除了信噪比的提高，MicroCal PEAQ-ITC系统具有完全自动化的数据分析，最大限度地减少分析时间和用户在评估数据质量方面的主观性。数据质量的确定和拟合在每次实验的几秒钟内进行，允许在几秒钟内分析50个或更多实验的大型数据集。