使用串联质量标记(TMT)试剂与SimGlycan自动化质谱定量糖组学

简介

糖组学研究的一个新兴趋势是与精确的基于质谱的聚糖定量分析相关的创新。最近，我们推出了氨基氧tmt试剂，可以有效地对碳水化合物进行相对定量，提高了标记聚糖的电离效率，提高了分析通量。这些试剂可用于直接或lc -耦合ESI-MS定量分析天然n -聚糖。然而，与蛋白质组学不同，未解决的主要挑战之一是缺乏信息学工具来自动化定性和定量分析协议。这些方案包括使用MS/MS数据对聚糖进行鉴定/定量，并对生物样品进行差异分析。SimGlycan软件被重新设计，以简化从复杂混合物中衍生的标记糖型的定量协议。

方法

用PNGase F糖苷酶处理几种标准糖蛋白和单克隆抗体的胰蛋白酶消化，释放n -聚糖。在反相和石墨化碳提取/脱盐步骤后，根据优化的协议用氧化tmt试剂标记聚糖。使用Velos Pro质谱仪(Thermo Scientific)在正离子模式下分析标记的聚糖，以获得陷阱- hcd MS/MS碎片。数据经SimGlycan鉴定样品聚糖的结构。鉴定后，我们将TMT 130.13离子作为对照。该程序允许自定义报告离子校正因子，计算报告离子强度的和/平均/中位数，鉴定聚糖的MS/MS谱的数量。不同类型的图表有助于不同样品之间的糖基差异分析。

初步结果/文摘

对于含有一个钠和一个质子加合物的双电荷前体，TMT报告离子峰簇是MS2光谱中最强烈的特征之一。为了测试软件的性能，获得了五种高甘露糖聚糖的HCD光谱。高甘露糖聚糖前体(780、861、942、1023和1124 m/z)的HCD破碎产生丰富的TMT报告离子以及Y/B/ a型离子。将MS/MS数据用SimGlycan进行结构鉴定。该程序识别了含有碳水化合物残基的n -聚糖(GlcNAc)2(Man)5为前体m/z值780,n -聚糖(GlcNAc)2(Man)6为861,n -聚糖(GlcNAc)2(Man)7为942,n -聚糖(GlcNAc)2(Man)8为1023,n -聚糖(GlcNAc)2(Man)9为1124，这是对样品中存在的所有高甘露聚糖的正确分配。大多数具有完整TMT标记的离子携带Na加合物，通常是两个糖苷向还原端裂解的产物。该程序通过测量报告离子峰值强度进行定量。为了消除附近其他峰对TMT报告离子的干扰，我们设置了一个自定义校正因子。作为样本中每种聚糖相对数量/表达水平的度量，统计数据包括报告离子强度的和/平均/中位数/标准差，每种TMT离子与对照TMT 130.13离子的和/平均/中位数强度的比值，这些比值的Log2相对表达式，识别每种聚糖的MS/MS谱的数量。通过不同的图表促进了差异分析和数据可视化。 Heat map displays relative intensities of TMT reporter ions for each identified glycan. Cluster dot plot shows Log2 expression levels of a glycan at different TMT reporter ions. The performance of the software for several standard glycoproteins and monoclonal antibodies were also examined in these studies.