用于精确基因分型和检测HCV和HIV耐药相关变异的Ion Torrent下一代测序

背景:耐药相关突变的检测在HIV抗逆转录病毒治疗(DRMs)中已经得到了很好的证实，并且越来越多地用于选择直接作用抗病毒药物(DAAs)治疗的HCV患者(RAVs)。无论是DAA治疗还是常规干扰素治疗，准确测定HCV基因型(GTs)都是至关重要的。桑格测序在敏感性和周转时间方面存在局限性。NGS具有卓越的准确性、速度和灵敏度，能够检测罕见突变体、HCV亚型以及混合感染。

目的:在自动化工作流程中，利用离子流为基础的NGS技术改进临床相关病毒突变的检测。

材料和方法:我们在基于emotion 5075系统(Eppendorf, Germany)新开发的平台上使用了NGS和工作流自动化，该系统由连续的机器人流程组成，从样本提取和RT-PCR开始，然后是自动化文库制备，Ion Torrent深度测序和直接在线数据分析，以确定HCV基因型和RAVs以及HIV中的DRMs。我们使用了来自HCV NS3、NS5A和NS5B区域的目标序列。对于逆转录酶中的HIV序列，NGS选择蛋白酶和整合酶。

结果:我们报告了一项对>200 HCV血清进行的评价研究结果，比较了HCV基因分型与线探针法。发现2例混合型GT感染。通过Sanger测序确认NGS和线探测结果之间的差异表明，NGS的GTs准确率为100%，而在一些情况下，线探测结果会导致选择次优治疗方案。在一项HIV试点研究(n=112例患者)中，将NGS结果与TruGene测序进行比较，圣淘沙SQ HIV基因分型试验检测出蛋白酶基因中100%(199/199)的所有突变，逆转录酶基因中超过98%的突变(427/435)。

结论:鉴于精确测序分析在HCV和HIV治疗管理中的关键作用，工作流自动化NGS似乎是区分HCV GTs和RAVs的高度可靠工具，这可以帮助防止可能导致次优治疗的诊断错误。

考虑到drm在HAART下HIV患者中的关键作用，圣淘沙SQ HIV基因分型工作流程似乎是检测临床相关HIV变异的有价值的新工具。与基于Sanger的系统相比，该工作流具有较高的灵敏度，而且周转时间相对较短，仅为两天，因此在HIV DRM检测方面提供了相关改进。