生活的Biotherapeutics产品生成主机。对于大多数biotherapeutics,也简略生物制剂,细胞系制造过程的基石。生物制剂中监管机构的批准、制造平台跨细菌(例如,大肠杆菌),酵母(例如,酿酒酵母)、昆虫和哺乳动物细胞系。哺乳动物细胞中产生的生物制剂,主导平台,绝大多数,在70%左右在中国仓鼠卵巢(赵)细胞系统。CHO细胞是哺乳动物宿主的主力,因为他们很容易使转染转基因编码蛋白质治疗,通常是单克隆抗体。CHO细胞也glycosylate蛋白质的方式像人类的蛋白质,使其适合蛋白质疗法具有良好的生产活动和适合人类。进一步,从过程的角度来看,他们很容易在悬浮生长格式和高密度,增强产生的大量的生物制剂。因为它们是仓鼠的起源、CHO细胞是人类传播病毒的可能性较小。尽管CHO细胞的最前沿biotherapeutic生产,其他细胞系也使用,如小鼠myeloma-derivedNS0线和老鼠脾脏骨髓瘤杂种细胞Sp2/0线。
此外,哺乳动物宿主细胞是用来生成一个广泛的治疗类。大多数生物蛋白质疗法,特别是单克隆抗体。不过,还有一个快速增长的非蛋白疗法哺乳动物细胞用来制造、多肽、核酸、碳水化合物和疫苗。作为主要的生物制剂类,重点一直放在优化蛋白质疗法,如产生和转化后的修改,但其他类也积极和持续的研究,如碳水化合物生物制剂。
控制聚糖:工程细胞系优化碳水化合物生物制剂
苏珊Sharfstein生物科学教授纳米科学与工程学院、纽约州立大学理工学院,试图了解培养条件和细胞生理学影响治疗蛋白质和碳水化合物的生产在哺乳动物细胞系。她利用合理的设计和“组学”工具来识别这些因素与工程细胞系的目标和文化条件,优化生产蛋白质和碳水化合物治疗。
生产过程对蛋白质疗法首先使转染宿主细胞与指令,使蛋白质。它是一个模板化的过程,即指令指定所需的氨基酸序列生成蛋白质治疗。相比之下,糖基化,碳水化合物的形成(或糖苷)债券的一个分子,蛋白质或碳水化合物,是一种无模板过程中,工艺等的生物合成途径。因此,糖基化的结果在异构替代糖蛋白的改变或碳水化合物的混合物。所有的哺乳动物细胞,包括赵细胞,生成糖基化的蛋白质。然而,生物合成途径,决定糖基化目前没有完全理解,很难控制合成糖蛋白的异质性或碳水化合物生物制剂。
改变不同力量、稳定、血浆半衰期,影响疗效和糖蛋白的生物计量要求。他们在免疫原性也不同,这可能影响到患者不良反应的速率。因此,工程哺乳动物细胞系有兴趣引导生产糖蛋白或碳水化合物的生物最好的改变。的Sharfstein实验室碳水化合物药物特别感兴趣吗肝素钠,世界上使用最广泛的抗凝药物。“肝素是屠宰场的产品,就像胰岛素是出现之前的DNA重组技术允许生产重组人胰岛素,“Sharfstein解释道。“我们的目标是创建一个新的范式,碳水化合物药品生产(如肝素)移动到相同的水平,产生作为生物工程产品cGMP(当前良好生产规范)的条件下。”
不幸的是,肝素主要是由肥大细胞,不适合培养。幸运的是,和在结构上类似密切相关硫酸乙酰肝素在几乎所有的哺乳动物细胞产生,包括适合延长细胞培养细胞,如CHO细胞和肥大细胞瘤细胞、肥大细胞的致瘤的变体。改变乙酰肝素硫酸盐的糖基化模式,需要工程师工艺等的生物合成途径。为了解决这个问题,在Sharfstein的作者的一项研究中,研究人员推断,糖基化的多基因操纵生物合成途径可能生成硫酸乙酰肝素与肝素的抗凝性能模拟。在这个“多路复用“基因组策略,调查小组工程小鼠肥大细胞瘤细胞系生产高硫酸盐硫酸乙酰肝素抗凝活动超过制药级肝素。转录组分析应用于比较表达糖基化酶的生物合成途径中肥大细胞和肥大细胞瘤细胞。研究确定了几个关键酶的糖基化生物合成途径,要么是——或者在肥大细胞表达下调。当这些酶过表达或交替淘汰CRISPR / Cas 9在肥大细胞瘤细胞,细胞生成的硫酸乙酰肝素抗凝活性高。
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解决大问题的“大数据”细胞系的生物生产力
除了工程细胞系将生产转移到支持改变,Sharfstein和她的实验室也应用蛋白质组学技术来提高治疗效率。目前,宿主细胞转染基因表达蛋白治疗,控制催化剂的放大和治疗选择试剂。单从池中克隆分离细胞,异形稳定和蛋白质治疗生产力和克隆最后被选中。所以,这是一个耗费时间和迭代选择过程。虽然可行,但它可能更多的时间有效如果增强蛋白质治疗生产力可以改造成细胞系在一个更系统的、有针对性的方式。
在CHO细胞系工作,一套组学方法,包括转录组、蛋白质组学、phosphoproteomic和表观基因组学应用于比较低收入和高收益曹克隆生产单克隆抗体的控制下巨细胞病毒(CMV)。这项研究发现转录因子阵营反应元件结合蛋白1 (CREB1)与巨细胞病毒单克隆抗体生产力较高的催化剂在曹克隆。CREB1必须磷酸化成为活跃;因此,调节法核蛋白质组和组织磷酸化蛋白质组的最终生产力在CHO细胞重组蛋白。“此外,我们有大量的数据证明低和高生产率克隆不同能源途径和核糖体和蛋白酶体活动,“Sharfstein讨论研究的结果。
一旦组学分析确定了可行的目标,影响克隆效率,这些特征可以改造成开发高产克隆细胞系。“理论上,我们可以利用组学发现和合理设计和建模工程师细胞系与生物过程的发展。CRISPR技术的发展,它变得更容易敲入或淘汰赛生物活动产生更好的、更有效的宿主细胞,我们预期这将成为未来的一个大方面细胞系的发展,“Sharfstein结束。
稳定的转基因插入dhfr营养缺陷型CHO细胞:选择过程
劳伦斯Chasin名誉教授,哥伦比亚大学生物科学学系用途计算方法在他的研究中发现信使rna剪接的复杂机制,包括在CHO细胞。最近,他和他的实验室一直感兴趣的工程CHO细胞系来帮助选择高产克隆。“选择过程高产、稳定表达曹克隆可能会很长,劳动密集型的。它可以首先介绍耐药性基因植入正常的CHO细胞或基因正确的生物合成不足营养缺陷型的CHO细胞,”解释Chasin的过程。营养缺陷型突变体的生物或细胞无法生存没有添加一个具体营养物,体内的正应变不需要为了生存,因为它产生的营养内生通过生物合成途径。“一个广泛使用的类型的CHO细胞用于重组蛋白生产特别缺乏二氢叶酸还原酶(dhfr)基因,使压力无法生存没有添加甘氨酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷,营养物质的混合物缩写碧,继续Chasin增长媒体。”“CHO细胞与感兴趣的基因转染,编码蛋白质治疗,以及dhfr基因,这两个都整合到基因组不同的位置在各种各样的克隆。CHO细胞的生存能力在媒体缺乏碧稳定增长dhfr随着基因的兴趣。”
这个阶段后,单一的克隆表达高水平的孤立的DHFR伴随的高水平的蛋白质的兴趣,通常是因为他们港口大量的基因副本。最好的最高的克隆生长特性然后选择制造蛋白质治疗。“收益率是依赖位置的基因整合到基因组,这是一个随机过程的机会,”Chasin阐述了。“克隆整合多重副本数量的基因也可以有较高的表达水平。尽管一个随机过程,拷贝数的选择可以增强与DHFR抑制剂治疗细胞,甲氨蝶呤。细胞数量足够高的dhfr基因合成足够的DHFR克服抑制剂,所以会选择,以及相对大量的邻近的转基因治疗。”随后选择更多的副本dhfr利用基因扩增的基因,可能发生的一种现象,自发地在CHO细胞。高产克隆生成的多个轮池放大与甲氨蝶呤剂量增加。这样,克隆的超过100份dhfr基因可以被孤立。”这种策略的缺点是耗时,而且高基因复制数量并不总是保证高水平的表达。替代,也可以是一个目标集成(s)到一个网站的可选择的基因在基因组,使高水平的基因表达,“Chasin解释道。
Multiauxotrophic CHO细胞:精明的选择方法
Chasin和他的团队最近还创建了一个multiauxotrophicCHO细胞系(CHO8A),可用于选择集成转基因的多个副本在一个下跌勺,私企的几轮的选择要求。这种方法还避免了需要治疗细胞合成试剂和抗生素,这是有利的。“我们摧毁了一系列基因编码对许多生物合成途径中的酶步骤嘌呤和嘧啶RNA和DNA的构建块。这导致了一个营养缺陷型的CHO细胞系,CHO8A,缺乏生存能力而提供的五个自然营养,“Chasin小说的描述方法。“然后我们cotransfect缺陷CHO8A细胞池的八个质粒,每一个窝藏转基因和基因(即不同的救援。、编码的嘌呤或嘧啶生物合成的酶都被打掉了CHO8A)和邻近的单克隆抗体轻、重链。”
只有整合所有八个基因转染克隆才会生存和生长在受欢迎的嘌呤和嘧啶媒体缺乏增长。此外,八个集成自动选择的概率克隆转染子积累了高总质粒的拷贝数(40 - 120)。“因此,我们发现相邻的单克隆抗体基因的表达水平与那些用于制造。另一个使用这种multiauxotrophic CHO细胞系的能力选择了8种不同的蛋白质或蛋白质亚基。此外,这种策略可以应用于其他细胞系,“Chasin结束他们的方法。
当被问及未来研究方向biotherapeutic细胞系发展生产,Chasin回答说,目前的瓶颈生产力现在看来可能是分泌的限制。“基因工程和选择方法对宿主细胞的能力明显高于分泌应该削减制造成本,行业和社会的一个重要目标。”
