类器官概论，类器官的创造，培养和应用

瀑样已经彻底改变了生物和医学研究领域，该技术已被证明是临床前研究中动物模型的绝佳替代品。在这里，我们将讨论什么是类器官，以及这些年来它们是如何发展成为流行的研究工具的。详细了解培养技术，以及各种类似肿瘤和身体结构的类器官的特征和应用大脑肺，肠，肝提供肾脏和视网膜。

类器官是一种三维(3D)细胞培养系统，可以被称为“迷你器官”，因为它们模仿了真正器官的一些关键的多细胞、解剖学甚至功能特征。

类器官指的是由组织外植体、肿瘤、干细胞或其他祖细胞衍生的不同细胞类型的3D培养，这些细胞类型在受控条件下自组织并分化为功能细胞类型，以获得器官或身体结构的复杂性、解剖学和生理学。来自原发肿瘤的肿瘤样器官称为类肿瘤。¹

1907年，有人提出可以再造复杂的器官/组织结构在体外因为亨利·范·彼得斯·威尔逊发现培养中的海绵细胞可以自我组织并再生成完全发育的生物。人们认为，培养细胞的这种自我组织和再生潜力可能被用来概括完整组织或器官的部分。标准的二维(2D)培养包括在烧瓶或培养皿表面生长和维持单个细胞类型的单层。然而，挑战在于如何获得细胞在自然环境中的三维空间结构。²

随后的3D培养尝试出现在20世纪50年代，当时Ehrmann和Gey用从老鼠尾巴中分离出来的胶原蛋白作为支架培养了各种人类细胞谱系。人们做了几次建模的尝试在活的有机体内在20世纪80年代和90年代，器官系统使用分离-重新聚集实验:例如，从鸡胚胎或小鼠胎儿肺分离的细胞被分离，并允许在培养中重新聚集。自1975年以来，科学家们开始专注于开发支架，以促进细胞-基质相互作用以及细胞-细胞相互作用所需的在体外细胞分化，就像在组织和器官中一样，因此带来了从2D培养到3D类器官的重大飞跃。用富含胶原蛋白和层粘连蛋白的漂浮凝胶或基质作为支架，在3D环境中培养从分离器官分离出来的组织或细胞碎片。^1，2

类器官发展的里程碑是1981年首次从小鼠和1998年首次成功分离出多能胚胎干细胞(ESCs)。2006年，Kazutoshi Takahashi和Shinya Yamanaka对小鼠成纤维细胞进行了基因改造，以开发小鼠多能干细胞(PSCs)。诱导或胚胎PSCs (iPSCs或ESCs)具有有效的自我更新和自组织能力，这是从组织或器官分离出来的原代细胞所缺乏的。PSCs是器官祖细胞，在培养中分化产生多种细胞类型，在培养中自我组织形成器官样复杂结构，非常类似于胚胎中器官形成的过程，直到出生。干细胞的发现改善了类器官技术，消除了分离和共培养几种细胞类型的需要，减少了对昂贵的分化介质和复杂支架的需要。此后，2007年人类诱导多能干细胞(hiPSCs)的建立彻底改变了类器官技术，促进了从单个个体发展出可用于多种用途的类器官在体外还有临床前研究。^3.，4

图1显示了近年来类器官发展的标志性事件。

图1: 一个时间轴，说明了研究和发展的显著成就，导致类器官技术的产生。缩写:ECM，细胞外基质;ESC，胚胎干细胞;诱导多能干细胞。资料来源:科技网188金宝搏备用络。

在21世纪初，类器官被开发出来，不需要使用凝胶或支架。细胞要么在表面张力的悬浮液滴中培养，要么在磁场悬浮的纳米颗粒培养基中培养。然而，无支架方法并没有得到普及，也没有进一步发展。细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)在肿瘤形成中起重要作用在活的有机体内器官的微环境和结构，以及天然或合成基质继续显著影响类器官的改善。从2012年开始，空气-液体界面(ALI)被用于启动类器官，细胞在浸泡在培养基中的凝胶中培养，使细胞的上层暴露在空气中，促进其极化和分化。ALI模型用于从细胞系、从ESCs分化的细胞或从皮肤分离的原代细胞中构建类器官。先进的生物工程和生物打印技术在过去十年中也改进了类器官培养技术，通过制造复杂的器官微结构作为支架，不同的细胞谱系可以在其上播种和培养在富集介质中产生“organ-on-chip”模式．Multiorgan-on-a-chip模型在一个芯片上特别设计的支架/隔室中包含不同类型的类器官，以便进行跨器官研究和疾病的多器官建模。^2，5

ESCs, iPSCs，体细胞干细胞和癌细胞都可以用于创建瀑样．细胞悬浮液或片段可以通过机械或酶解从组织、器官或冷冻保存的类器官中获得。这些细胞或组织碎片首先在低附着板或培养容器上的分化培养基中播种5-7天，以生成称为球体的3D细胞聚集体。球体的形成也可以使用普通悬浮培养，微型生物反应器或滚筒瓶进行。然后将这些球状体植入液体ECM、基质或琼脂糖基凝胶中。该方案根据所使用的祖细胞和要概括的器官/组织结构进行调整:在某些情况下，从分离组织或类器官中获得的细胞被悬浮并直接播种到液体ECM中，跳过分化步骤。凝胶在37℃下聚合获得3D培养，并辅以类器官特异性的膨胀和成熟培养基，以刺激所需细胞类型的生长，从而形成类器官结构。例如，补充了生长因子EGF的培养基刺激上皮和肿瘤类器官的生长;而成纤维细胞生长因子10在胃癌、乳腺癌和肝癌类肿瘤中是必需的。^2，6

一般来说，完全生长的功能性类器官在成熟培养基中30-60天(甚至更长)后生成，每周补充两次。通过每10天更换一次或两次成熟培养基并传代类器官，这种成熟的类器官可以维持约100天(有时长达一年)。传代时，去除成熟培养基，用温和的细胞解离试剂将类器官轻轻打碎成更小的片段，持续15-20分钟，然后大力移液。经过几个离心和洗涤步骤后，最终得到的类器官颗粒在液体ECM中重悬，重复整个类器官生成的过程。类器官可以冷冻保存，新鲜的类器官可以由这些冷冻的类器官完全分离产生。^2，6该方案对要重建的目标器官或身体结构具有高度适应性，广泛的专门介质和介质补充，以及其他材料，如转井、井板或基质，都可以在商业上获得，以提升类器官技术的各种系统。

图2提供了类器官生成和培养协议的示意图。

图2: 从人类胚胎、器官或肿瘤生成类器官的示意图表示。缩写:ECM，细胞外基质;ESC，胚胎干细胞;诱导多能干细胞(iPSCs);SC，干细胞;3 d三维。 资料来源:科技网188金宝搏备用络。

类器官和球状体都是利用组织外植体或细胞共培养的3D多细胞培养技术。球状体是在培养过程中自发形成的球形、自由漂浮的细胞集合体。类器官是一种先进和更复杂的球状体形式，其结构单位在很大程度上类似于器官。²

虽然术语类器官和椭球体可以互换使用，但类器官和椭球体之间有细微的区别^1，3.如下表所示:

差异	球体	瀑样
细胞类型	多种细胞类型，包括细胞系、肿瘤细胞、原代细胞和混合细胞	至少一种内皮细胞和一种间充质细胞类型，包括干细胞、诱导多能细胞和肿瘤细胞
体系结构	类似于单个组织或3D细胞结构	类似于多个组织或器官的
Form	多层异质增殖、坏死或静止的细胞	分化细胞的复杂结构
组装	具有细胞粘附和细胞间聚集的自组装	对物理和化学线索作出反应的分化细胞的自我组装
组织	某些模型中的自组织	自组织成复杂的结构和模式
补充	无论有无细胞外基质和生长因子，都不需要昂贵的支架	需要生长因子、细胞外基质和昂贵的支架;没有支架的类器官需要额外的附件
时间和复杂性	更低的复杂度，更短的生成时间，比类器官更便宜	复杂度更高，生成时间更长， 比球体贵

的类器官的优点在标准细胞培养方法或球体将在下面讨论。

• 器官特征的保存:与标准细胞培养方法相比，类器官的主要优势是培养细胞的3D空间排列，这模仿了它们的自然形态。在类器官发育过程中，祖细胞如何分化和组装成类器官结构，遵循类似于胚胎最终转化为婴儿时器官的自然形成机制。因此，与标准细胞培养物甚至球形细胞相比，类器官保存了细胞的细胞和分子机制。这些特性使类器官成为研究整个器官和特定区域器官生成和功能的优秀模型。²
  
  
• 细胞间和细胞-基质相互作用:ECM提供了主要的结构组织，并允许细胞功能和通信，以确保生物组织和器官的正常功能。类器官允许多种细胞类型之间的相互作用，类似于类器官的复杂结构，这是任何标准的单层培养、球形甚至两种或多种细胞类型的共培养都不可能实现的。类器官提供了在3D水平上研究细胞与ecm相互作用以及细胞与细胞相互作用的机会。^1，2
  
  
• 物种的具体表现和动物模型的替换:人体类器官的使用消除了物种特有的机制，为研究人体器官的动物模型提供了有效的替代方案，因此提供了在“人体模型”系统内进行机制研究的机会。²
  
  
• 个人层面的建模:类器官是从单个个体或患者中生成的，以提供个体水平上的细胞、形态学和其他科学数据。甚至tumoroids保存个体患者原始肿瘤/癌症的组织病理学和遗传特征。类肿瘤、特定于单个器官的多类器官或多器官芯片允许研究个体的疾病发病机制或集体治疗反应。^1，2，7
  
  
• 高通量高效临床前模型:更像在活的有机体内与球形或标准细胞培养相比，类器官系统可以有效地用于疾病机制建模和测试候选药物和其他疾病治疗干预措施的疗效。许多类器官可以从有限的人体材料中产生，因此可以对这些类器官同时进行多项测试。因此，的时间轴药物筛选和测试之间的差异减少了在体外测试和患者的实际反应被最小化，这反过来又减轻了药物上市前生产、临床前和临床试验带来的经济负担。^1，7

过去十年的开创性工作已经建立了人类衍生的类器官，用于模拟肿瘤、胚胎和广泛的组织和器官，下面重点介绍了其中一些。

大脑瀑样

由几种细胞系组成的人类PSCs衍生的类器官可以概括细胞和区域相互作用以及大脑血管的形成。大脑瀑样类似于大脑的特定区域或多个大脑区域和/或细胞谱系的组合，作为研究人脑发育、功能和功能障碍的代表性模型。人类psc衍生的脑类器官模型已被用于研究小头畸形的基因突变、自闭症谱系疾病和癫痫的异常抑制神经元、帕金森病的发病机制和寨卡病毒在大脑中的感染机制。^1，8，9

肺瀑样

人类呼吸道类器官已成功用于研究呼吸道合胞病毒和流感病毒的感染机制。²此外，他们还作为研究严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)感染及其后续药物筛选的代表性实验模型。为了研究SARS-CoV-2的发病机制，并促进新疗法的开发，已经开发了来自不同类型细胞的其他几种肺泡类器官，这些细胞模拟肺部的特定区域或多个区域的组合。包括25-羟基胆固醇、瑞德西韦和卡莫司他在内的1000多种药物在用于人体之前，在肺类器官模型中测试了它们对SARS-CoV-2的有效性。^2，10

肠道瀑样

复杂的肠道不对称结构，包括隐窝和绒毛，在类器官中由单个肠道干细胞重建。高度特化的上皮屏障在肠道的功能和稳态中起着重要作用。类器官已经允许成功鉴定可药物的生物靶点以及小分子药物作为屏障上皮的组成和运作的调节器。使用类器官重建的小肠和结肠肠上皮细胞可作为研究SARS-CoV-2 Omicron变体传染性的有前途的模型。^11-13

肝脏瀑样

来自人原发性肝星状细胞和诱导多能干细胞的多细胞肝类器官已被有效应用于非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎的肝纤维化、脂质代谢和遗传稳定性建模。肝类器官被用来将祖细胞或PSCs分化为肝细胞和肝芽。这些细胞可以高效地移植到小鼠体内，生成成熟的肝细胞，甚至血管化成功能齐全的肝脏在活的有机体内．这些发现暗示了类器官在器官损伤或器官衰竭的肝移植中的潜在作用。^2，14

肾脏瀑样

近年来，改进的生物工程技术已经实现了高度复杂的肾脏类器官，从而可以模拟多种疾病，包括多囊肾病、囊性纤维化、肾细胞癌和病毒感染。在临床试验中，19%的药物失败是因为肾毒性。因此，最近在肾类器官中测试了几种常见药物，如顺铂、庆大霉素、阿司匹林和青霉素G，以进行预选。在sars - cov -2感染的肾类器官中测试了人重组可溶性血管紧张素转换酶2的治疗效果。来自患者来源的iPSCs的类器官也被用于研究先天性肾病综合征的基因突变和个性化治疗。¹⁵

肿瘤瀑样

最近类器官技术的改进已经利用原代细胞或癌细胞系概括了肿瘤微环境，肝肾和心脏的培养来自多种癌症类型的类器官可以冷冻或长期培养，保持其形态、组织病理学、表观遗传机制和遗传谱，以研究癌症进展和肿瘤的临床特征。针对脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌的患者源性类器官(pdo)生物库已大规模开展，以适应癌症患者的临床异质性，为免疫治疗和精准医疗提供便利。^7，16

视网膜瀑样

视网膜类器官已经成功地从视网膜干细胞中开发出来，并独立于ESCs，能够在很大程度上模仿健康眼睛的视觉周期和对光的反应。视网膜疾病色素性视网膜炎、莱伯氏先天性黑蒙、视网膜母细胞瘤和青光眼的发病机制中涉及的基因突变已经使用视网膜类器官进行了有效的建模。将hipsc来源的色素感光细胞移植到人类视网膜可能改善老年性黄斑变性的视力。²

考虑到上述优点，类器官在基础研究、发育生物学、组织工程、药物测试和筛选领域提供了潜在的应用和进步。^1，7患者来源的类器官在精确医学和再生医学中的细胞治疗应用中具有潜在的意义。⁷

药物发现

类器官可作为药物毒性测试、药物发现、筛选和验证的快速可靠方法。迄今为止，已对238种已上市药物的肝脏类器官毒性、25种已上市药物的心脏类器官毒性、顺铂和庆大霉素的肾脏类器官毒性、39种已上市药物的肠道类器官毒性以及长春新碱和鱼藤酮的脑类器官毒性进行了测试和报道。¹⁷在COVID-19大流行期间，类器官技术在发现疗法和治疗靶点方面发挥了重要作用:可以使用多器官芯片类器官同时在多个器官上测试治疗COVID-19的潜在候选药物的效率和毒性。^17，18

疾病模型

基于人类ipsc的类器官对病原体敏感，并提供了一种在细菌或病毒感染期间模拟宿主-病原体相互作用的潜在手段。大脑和神经类器官被用来模拟寨卡病毒感染。肠道类器官已成功模拟轮状病毒病理生物学，胃类器官已被用于模拟细菌感染幽门螺杆菌．人类psc来源的肺类器官揭示了SARS-CoV-2感染的各个方面，包括细胞嗜性、遗传特征如何影响病毒感染的易感性、病毒进入和复制在宿主中的机制、宿主细胞反应以及感染后的细胞和代谢变化。^19，20.

病理突变可以通过CRISPR-Cas9或其他基因编辑方法引入健康的类器官，以研究这些突变在癌症发展中的影响。通过在基因中引入驱动突变，结直肠腺瘤癌可以被复制APC，喀斯特，TP53，SMAD4而且PIK3CA而胰腺导管腺癌可通过突变驱动基因而发展喀斯特，CDKN2A，SMAD4而且TP53在健康的类器官中^2，19

发育生物学

类器官可用于模拟形态发生事件，为组织和器官的发育和功能提供详细的见解。由小鼠和人类的ESCs组成的类器官在培养中自我组织和原肠胚形成胚胎，为早期哺乳动物发育提供了新的见解。此外，类器官为研究不同条件下的自组织机制提供了模型系统，增加了我们对复杂多细胞行为的自组织和控制的理解在体外．⁷

除了ESCs，来自特定组织的iPSCs和PSCs对于研究特定组织和器官的发育生物学也至关重要。类器官再造了女性生殖系统的不同部分，极大地提高了我们对生殖器官的理解，并为患有并发症的女性提供个性化护理。2019年，成功建立了含有色素毛囊的皮肤层的皮肤类器官，这可能在皮肤再生治疗中发挥重要作用。^2，21-23

个性化医疗

类器官是研究疾病发病机制中人与人之间的差异、个体对治疗的反应以及针对个体需求的治疗的最佳模型。¹类器官提供了研究器官发育和功能、疾病进展或感染/过敏的各种共享或独特机制的潜力，这些机制可能与不朽细胞系或动物模型中涉及的机制不同。⁷对类器官生物库的筛选显示，结直肠、乳腺、前列腺和肝脏的基因谱与药物反应之间存在相关性癌症．基于类有机化合物的数据，临床决定用新辅助化疗方案FOLFOX治疗患者，改善了一名患者的肝癌。一项患者来源类器官的研究在预测转移性胃肠道癌患者对药物治疗无反应方面提供了88%的准确性，在预测转移性胃肠道癌患者对药物治疗无反应方面提供了100%的准确性。^6，21，24

考虑到类器官的巨大潜力，目前的研究广泛集中在改善类器官个性化医疗治疗各种疾病和发育状况^24，25

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