DNA甲基化在人类疾病中的作用

DNA甲基化是最早的一种表观遗传修饰在人类身上被发现。它涉及甲基(CH)的转移_3.甲基胞嘧啶(5mC)是由脱氧核糖核酸(DNA)组成的胞嘧啶碱基的C5位置上的一种酶DNA甲基转移酶(DNMTs)．通常，改变的胞嘧啶碱基位于鸟嘌呤碱基附近。这导致两个5mC碱基在互补的DNA链上对角线排列。

DNMTs有几个不同的角色，例如，它们可以作为新创DNMTs，包括在DNA分子上建立甲基的初始模式。而其他dnmt则扮演维护角色，在复制发生后将现有DNA链的甲基化模式复制到其新伙伴。

20世纪80年代的一些研究表明，DNA甲基化在基因调控和细胞分化中都起着重要作用。此后，进一步的研究证实了甲基化异常在前列腺癌发生发展中的作用各种各样的疾病．根据EstellerJosep Carreras白血病研究所所长，巴塞罗那大学遗传学教授，“DNA甲基化是特定组织表达的主要控制者之一，允许基因在正确的器官或细胞类型中正确表达。”他进一步补充说:“DNA甲基化是稳定我们基因组和抑制重复染色体区域的缓冲器。许多疾病显示DNA甲基化的改变会破坏细胞活动。”埃斯特勒的研究主要集中在人类癌症中DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质的改变。目前，他正致力于建立正常细胞和转化细胞的表观基因组和外延脚本组图谱。

在哺乳动物中，甲基化大多是稀疏的，但在特定的CpG或CG(胞嘧啶-鸟嘌呤)序列中全球分布。在基因组的某些区域，CpG被大量发现(例如，CpG岛)。在健康细胞中，CpG岛相关基因启动子通常没有甲基化，而在基因体中发现的岛往往在发育过程中甲基化。研究人员指出，启动子区CpG岛的甲基化会导致特定基因的不适当下调(例如，癌细胞中抑癌基因的沉默)。

DNA甲基化在正常生物过程中的作用

的作用和地位DNA甲基化在不同的生物王国中有所不同。如上所述，哺乳动物倾向于拥有相当全球性的CpG甲基化分布，而无脊椎动物通常表现出甲基化的“马赛克”模式。

DNA甲基化在许多疾病中起着重要作用生物过程例如，基因组印迹、干细胞分化和染色体稳定性，被认为是 调节细胞生长和增殖的基本修饰。DNA甲基化模式是可变的和可遗传的，如果亲本等位基因的DNA甲基化异常，就可能发生各种严重疾病，如癌症、衰老障碍、代谢疾病、心理障碍和遗传疾病。

DNA甲基化和疾病

科学家首次发现DNA甲基化在人体中的作用人类疾病在研究基因组印记．基因组印记是一种稳定的、可遗传的现象，它独立于经典孟德尔过程。它涉及基因的表观遗传标记(例如，甲基化)，基于其亲代起源，导致基因的差异表达而不修改底层DNA序列。在这里，我们强调一些由异常DNA甲基化引起的疾病。

自身免疫性疾病

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性炎症性疾病，可引起大小关节的对称性多发性关节炎。科学家对外周血单个核细胞进行了全基因组DNA甲基化分析，发现人类白细胞抗原(HLA) II类DNA甲基化改变。这种异常的DNA甲基化可以促进发展类风湿关节炎的遗传风险。

系统性红斑狼疮SLE是一种自身免疫性疾病，患者的免疫系统会错误地攻击自身的健康组织。DNA甲基化的全基因组评估表明，SLE患者的基因中存在差异DNA甲基化，与自身抗体的产生有关。在基因的启动子区观察到异常的DNA甲基化il - 6基因．

代谢紊乱

科学家们还将高血糖和高血脂等疾病与导致异常基因表达的差异DNA甲基化联系起来。减少甲基化周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A和磷酸二酯酶7B启动子显示葡萄糖刺激胰岛素分泌紊乱。DNA甲基化也与肥胖有关，脂肪组织和血细胞中缺氧诱导因子3 α的DNA甲基化增加会导致肥胖身体质量指数(BMI)。

癌症

甲基化是最早的变化之一多种癌症类型而在无细胞DNA中检测甲基化状态是一种很有前途的非侵入性早期癌症检测途径。最近,组学(基因组学、蛋白质组学、转录组学和代谢组学)的研究为这些发现提供了支持证据，证实了异常的DNA甲基化与肝细胞癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、鳞状细胞肺癌、白血病和甲状腺癌有关。DNMTs表达水平的差异和DNMTs突变在癌症患者中常见，这两者都影响甲基化机制。先前的研究已经表明表观遗传失调在肿瘤的发展和转移中起着至关重要的作用。

“在癌症中，我们观察到基因组的整体DNA低甲基化和更多的局部DNA高甲基化，这影响了通常在启动子处发现的富含CpG的序列(所谓的CpG岛)，”教授解释说Gerd Pfeifer范安德尔研究所的表观遗传学中心。Pfeifer的实验室研究癌症和其他疾病的潜在机制，特别关注DNA突变、DNA甲基化和5mC氧化的作用。根据Pfeifer的说法，癌症中的大多数DNA高甲基化事件都是无关紧要的，因为基因已经沉默了。然而，一些甲基化事件可以被认为是肿瘤驱动因素，例如，当它们沉默编码抗增殖因子的基因、DNA修复基因或正常细胞分化所必需的基因时。

Paula Esteller-Cucala 她是进化生物研究所(IBE)比较基因组学组的博士研究员，主要研究非人类灵长类动物的表观遗传学和转录组学。她说,“甲基化模式是非常不同的。它们可能因癌症类型不同而不同，也可能因细胞类型不同而不同。了解这些修饰的作用及其在不同癌症类型中的作用，对于寻找潜在的治疗方法和疗法至关重要。”识别癌症特异性DNA甲基化标记(在一种或多种癌症类型或亚型中特异性甲基化或非甲基化的基因组区域)，可用于检测和监测癌症，以期制定治疗策略。

神经胶质瘤是一种常见的脑癌，它起源于支持大脑神经元的神经胶质细胞。最近，研究人员使用单细胞多组学方法来研究识别从胶质瘤患者获得的单个肿瘤细胞内的甲基化标记。他们能够确认DNA甲基化的不同模式，负责将细胞从一种状态转移到另一种状态(例如，干细胞样状态到成熟状态)，并从样本肿瘤中绘制出细胞状态图。从这项研究中获得的见解可能有助于开发更好的方法来检测、分期、监测和治疗这种疾病。

神经系统疾病

DNA甲基化异常也与神经系统疾病有关。甲基- cpg结合蛋白2基因突变已被发现在患者Rett综合症而且自闭症谱系障碍．科学家们发现，DNA甲基化谱的改变促进了与突触活性相关的基因表达的改变。

患者外周血中儿茶酚- o -甲基转移酶甲基化水平降低精神分裂症．

表观基因组范围的关联研究比较三种不同哺乳动物组织的甲基化模式，以确定是否亨廷顿氏舞蹈症伴随着DNA甲基化的改变。研究人员发现，这种疾病与DNA甲基化水平的“深刻变化”有关。

一个系统性回顾阿尔茨海默病中DNA甲基化的研究发现应用程序编码淀粉样蛋白前体蛋白的基因与淀粉样斑块的形成有关，在大脑和外周血中一直高甲基化。

用于研究DNA甲基化的技术

根据Pfeifer的说法，“大多数常规的分析方法 DNA甲基化模式是基于使用高温和高浓度亚硫酸氢钠化学脱氨将胞嘧啶转化为尿嘧啶，而一些较新的方法使用酶来脱氨。”通常，病理学家面对困难用于预测癌症的生物标志物，并从肺癌患者的小活检组织样本或液体样本中代表肿瘤块的整体状态。在这种情况下，Pfeifer说:“这些新的酶方法可以让研究人员使用非常少量的酶 DNA(活检样本)”。

超越传统方法，测序和阵列技术的最新进展使研究人员能够进行详细的 DNA甲基化分析，提供了其在疾病中的作用的全面图景。在埃斯特勒-库卡拉看来，最新的研究方法 DNA甲基化是通过长读测序来实现的——这些技术允许读取更长的序列(> 10000 bp）.

埃斯特勒也提出了他的想法，“这项技术最广泛地用于以一种具有成本效益的方式研究人类 DNA甲基化是基于 DNA甲基化微阵列可以检测我们基因组中的850K CpG位点。”

一些技术 使用来确定 DNA下面将更详细地讨论甲基化。

Bisulfite-based化验

亚硫酸氢盐处理是常用的方法，介绍了由Frommer等人(1992)，用于分析5mC和非甲基化碱。在这种方法中，基因组DNA暴露于亚硫酸氢钠，亚硫酸氢钠促进非甲基化胞嘧啶脱氨并将其转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持不变。最后，随后的PCR扩增将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶。这导致基因甲基化信息转移到新形成的测序文库。科学家们使用亚硫酸氢盐测序方法分析得到的单链中的5mC。该技术可用于确定多个DNA甲基化事件;然而，克隆和测序等多个步骤使其成为一种耗时的方法。这种方法的一些其他限制包括降解DNA样品，由于所需的侵略性化学条件，如低pH值和高温来实现脱氨。因此，样品降解导致灵敏度下降，使其不适合分析低浓度的样品，如ctDNA。然而，较弱的治疗不能转化所有未甲基化的胞嘧啶，因此，可能会高估甲基化水平。

甲基化特异性PCR (MS-PCR)是一种先进的测序技术，可以避免复杂的测序过程。

酶技术

基于酶法的甲基化检测在温和的反应条件下快速且高特异性，这意味着它可以获得与亚硫酸氢盐法相同的最终产物，而不会损害DNA的完整性。酶methyl-sequencing(EM-seq)可以通过t4 -噬菌体β -葡萄糖基转移酶(T4-BGT)、Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2 (TET2)和载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A (APOBEC3A)这三种酶来检测5mC和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。EM-seq是一个两步反应过程。第一步是通过TET2和T4-BGT酶对5hmC进行糖基化，产生不能被APOBEC3A脱氨的产物。第二步涉及APOBEC3A酶，它通过将未修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶来脱氨。

甲基化敏感限制性内切酶(MREs)的一些例子包括HpaII, BstUI, NotI和smi。这些酶只切割非甲基化的目标区域，并保持甲基化DNA的完整。这些MRE切片随后被测序，以预测基因组水平的DNA甲基化水平。最近，科学家开发了一种先进的酶解技术，称为甲基化敏感限制性内切酶pcr /southern (MS-RE-PCR)。

直接氧化和化学氧化分解

科学家们已经开发出一种基于电化学的方法来直接分析DNA甲基化。为此，我们设计了氯化胆碱单层负载的多壁碳纳米管(MWCNTs/Ch/GCE)。该技术具有高度特异性，精确和快速，不需要使用酶，探针或亚硫酸氢盐。另一种新的化学方法是基于化学氧化分解，可以分离5mC。该方法使用2-甲基-1,4-萘醌发色团进行光敏氧化。化学切断法有效地检测甲基化位点。

DNA甲基化研究的方法学挑战

研究DNA甲基化的方法很多，但每种方法都有其局限性。例如，如上所述，与亚硫酸氢盐为基础的方法相关的化学处理导致DNA降解，并获得更短的DNA片段用于进一步分析。虽然长读测序技术被认为是一种高度精确的方法，Esteller-Cucala指出，“这种方法的主要警告是你需要好的工具(算法)来检测甲基化位置”。

Pfeifer指出了一些额外的考虑因素，“一个挑战是实现整个哺乳动物基因组的覆盖，其中有超过2500万个CpG序列可以甲基化。为了对这些cpg中的每一个甲基化状态进行定量分析，需要深度测序覆盖，这仍然是昂贵的。有更实惠的方法可以用来分析cpg的子集，但这些方法可能会错过一些关键的甲基化变化。”

对于全面的DNA甲基化研究，可能需要大量的DNA，因此，当组织样本稀缺时，分析变得具有挑战性。“有时很难区分5mC和5hmC，”Esteller说。

DNA甲基化与临床益处

DNA甲基化异常与许多疾病相关，基于DNA甲基化的生物标志物有助于改善疾病预后和治疗反应。“DNA甲基化领域的一个临床兴趣领域是利用改变的DNA甲基化模式进行癌症诊断。这些改变可以在“液体活检”中检测到，“液体活检”来自患者的血液样本。最终，基于无细胞血浆DNA甲基化谱变化的癌症早期检测将成为可能，”Pfeifer解释说。他继续说:“我们有兴趣了解良性或癌症前体病变中存在的甲基化变化是否有可能促进向恶性状态的发展。”几家公司目前正致力于开发基于甲基化状态和基于人工智能的病理预测的早期癌症检测测试。

Esteller解释说，根据对肿瘤细胞DNA甲基化格局的了解，肿瘤领域出现了三种翻译用途:“发现了新的疾病生物标志物，甚至可以在生物体液中检测到，并允许其病理分类;利用某些基因中的DNA高甲基化事件作为对治疗反应的预测因子，帮助癌症精准医疗;以及将DNA甲基化作为表观遗传药物的靶点，如用于治疗血液系统恶性肿瘤的DNA甲基化抑制剂。”