什么是流式细胞术?gydF4y2Ba

当涉及到在实验室环境中分析细胞时，流式细胞术是一种广泛使用和全面的单细胞分析方法。本文概述了流式细胞术是什么，它是如何工作的，存在的不同类型，如何分析数据，以及流式细胞术的未来。gydF4y2Ba

什么是流式细胞术?gydF4y2Ba

流式细胞术是一种用于分析细胞的技术，用于各种目的，包括细胞计数、表型、细胞周期评估和活力。流式细胞仪中激光产生的光被样品中的细胞散射，由探测器测量，然后转化为可以分析和测量的信号。gydF4y2Ba

流式细胞仪是如何工作的?gydF4y2Ba

来gydF4y2Ba从流式细胞术开始gydF4y2Ba，第一步是准备待分析的样品。细胞从gydF4y2Ba细胞培养gydF4y2Ba血液，或分解的组织，应制成悬浮液。这种细胞悬浮液被分为几个管gydF4y2Ba染色gydF4y2Ba，保留一组未染色细胞作为对照。其他样本通过添加荧光探针标记的抗体或染色细胞成分的染料进行染色。在分析细胞内蛋白质时，首先必须将细胞固定(在福尔马林缓冲液中)并渗透(使用渗透剂)，以允许抗体和染料进入细胞。在与抗体或染料孵育后，细胞在缓冲液中洗涤，并在以盐为基础的缓冲液中重新悬浮以进行分析。然后将制备好的样品引入流式细胞仪。gydF4y2Ba

流式细胞仪主要有三个组成部分:gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba流体学光学和电子学在细胞仪的中心部分-流式细胞-样品材料遇到激发光并散射随后被检测系统捕获的光。gydF4y2Ba

图1:gydF4y2Ba流式细胞仪的主要组成部分。gydF4y2Ba

1.的gydF4y2Ba应用流体学gydF4y2Ba系统包含鞘液(盐基缓冲液或水)，通过机器加压，引导细胞样品经过激光，对每个细胞进行单独测量。gydF4y2Ba

2.的gydF4y2Ba光学gydF4y2Ba由激光器和光电倍增管(pmt)组成，前者向样品发射光，后者收集样品散射的信号。gydF4y2Ba

3.最后是细胞仪gydF4y2Ba电子产品gydF4y2Ba将检测到的信号转换为可使用软件进行分析的数字参数。gydF4y2Ba

什么是前向散射、侧向散射和荧光信号?gydF4y2Ba

流式细胞仪的三种主要输出测量是正向散射、侧面散射和荧光信号。激光的可见光从每个细胞反射，提供了细胞的一般大小和形状特征。gydF4y2Ba

图2:gydF4y2Ba向前散射。gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba向前散射gydF4y2Ba(FSC)是来自向前方向的散射，反映了细胞的大小。散射是沿着激光的路径测量的，每个细胞会使光线在细胞周围弯曲，从而引起衍射。因此，FSC的强度反映了细胞的直径。gydF4y2Ba

图3:gydF4y2Ba散射。gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba边撒gydF4y2Ba(SSC)是在激光束90度处测量的散射，反映了细胞的粒度或复杂性。细胞内的结构会改变进入细胞的光波的方向，从而产生特定的细胞结构，如颗粒和细胞核，来折射光线。SSC越强，折射越多，细胞内的颗粒度就越高。gydF4y2Ba

图4:gydF4y2Ba 荧光信号。gydF4y2Ba

第三个输出度量是gydF4y2Ba荧光信号gydF4y2Ba．这是激光激发荧光团时发出的光。荧光团是一种分子，可以在激发时吸收并重新发射光。来自激光光源的光子被荧光团的电子吸收，将它们移动到更高的能量状态。然后这些电子以光子的形式释放能量回到基态。这些光子的波长受到在这个过程中分子相互作用所损失的能量的影响。每个荧光团都有自己的发射光谱，这些光谱可能与其他荧光团部分重叠。荧光团可以用来标记抗体，抗体可以与细胞上或细胞内的特定抗原结合，从而检测到特定抗原，或者可以用作直接染色细胞的染料，例如，通过与DNA结合。gydF4y2Ba

流式细胞术使用什么仪器?gydF4y2Ba

至少，一个细胞仪将包含一个激光、一个检测器和一个流体系统，以确保细胞通过激光束的快速流动。近年来，细胞仪中激光的数量以及探测器的数量和质量都有了显著的提高。这些进展扩大了可以一次性检测到的标记的数量。gydF4y2Ba

流式细胞仪可用于特定目的。例如，为了允许高通量的样品，可以合并孔板加载器，以实现对多个样品的快速分析。gydF4y2Ba

流式细胞仪仪器的发展gydF4y2Ba

为了增加多参数分析并允许更深入的评估，已经开发了其他类型的细胞仪:gydF4y2Ba

质量血细胞计数gydF4y2Ba ^2gydF4y2Ba (飞行时间gydF4y2Ba质谱分析gydF4y2Ba或cyTOF):该技术使用带有重金属离子标签的抗体，而不是用荧光团标记的抗体。超过100种金属探针可提供有限的信号重叠，允许比传统流式细胞术更高维的分析。因此，可以用这种技术进行深入的表型分析，在免疫学和癌症等研究领域很有用。与传统流式细胞术的主要区别在于，用于分析的含有细胞的液滴在流室中被汽化、雾化、电离，质谱仪检测产生的离子。离子从样品到检测器的飞行时间用于分析。gydF4y2Ba

谱流式细胞术gydF4y2Ba ^3.gydF4y2Ba :光谱流式细胞术不是评估每个荧光团的峰值发射，而是使用一系列检测器来测量每个荧光团的整个光谱。然后使用算法分离这些光谱。这允许使用具有重叠光谱的荧光团来增加在一个实验中分析的参数的数量。gydF4y2Ba

成像血细胞计数gydF4y2Ba ^4gydF4y2Ba :这种类型的细胞术结合了传统流式和荧光显微镜。此外，该技术还允许评估细胞的形态，并可用于可视化蛋白质的共表达、细胞结合、蛋白质的核易位和免疫细胞突触。gydF4y2Ba

细胞分类gydF4y2Ba

荧光激活细胞分选仪(FACS)是一种使用流式细胞仪对细胞进行分选以进行进一步分析或实验的设备gydF4y2Ba ^1gydF4y2Ba ．不是仅仅测量细胞特征，而是根据特定的特征选择细胞，并将其引导到收集容器中，以纯化特定类型的细胞样本。使用FACS的一个例子是从血液中的外周血单核细胞(pmcs)样本中获得T细胞。由于分选后通常需要进一步培养细胞，因此分选必须在无菌条件下进行，并且该过程要温和，以避免损伤细胞并降低其活力。由于这个原因，细胞分选不能在质谱中进行，因为用于分析的细胞被破坏了。分选器可以是传统的流式细胞仪或基于光谱的。gydF4y2Ba

对特定参数为正或负的细胞群进行排序。利用单细胞样品液体流的高频振荡来分离细胞，以产生具有正电荷或负电荷的液滴。然后，液滴根据电荷被引导到收集容器中。gydF4y2Ba

流式细胞术数据如何分析?gydF4y2Ba

直方图和点图是从gydF4y2Ba流式细胞术数据gydF4y2Ba收集以进行分析。但是首先，为了进行准确的分析，应该采取几个处理步骤。gydF4y2Ba

存活单细胞的选择gydF4y2Ba

一般来说，分析将从基于某些特征选择感兴趣的单个细胞开始，这是通过称为门控的过程来完成的。分析软件允许用户在某些细胞群周围画线，称为门，以选择它们进行进一步分析。重要的是gydF4y2Ba单细胞门gydF4y2Ba作为双峰，同时通过激光的细胞，可以导致其中一个细胞发出假阳性信号。使用点阵图显示FSC和SSC数据，选择感兴趣的群体的大小和粒度的单个细胞进行进一步分析。gydF4y2Ba

此外，它是必不可少的gydF4y2Ba生存之门gydF4y2Ba，因为死亡细胞倾向于释放更多的自发荧光，这可能会影响分析。自体荧光可能与某些荧光团重叠，导致假阳性信号。使用活性染料评估细胞活力，活性染料可以与dna结合或与细胞内外的游离胺基团反应。gydF4y2Ba

补偿gydF4y2Ba

分析的下一步是评估每个细胞测量的特定荧光信号。由于在可用荧光团的发射光谱中存在重叠，具有多个荧光团的实验可能需要补偿。gydF4y2Ba ^5gydF4y2Ba 重叠光谱会导致假阳性，因为被测信号来自另一个荧光团。因此，适当的实验设计对于构建具有最小光谱重叠的荧光团面板至关重要。即使这样，也经常需要对重叠进行校正或补偿。阳性和阴性对照样品指导补偿，理想情况下使用所研究的细胞类型，或者如果不可能，使用补偿珠。gydF4y2Ba ^5gydF4y2Ba 补偿可以在测量过程中设置，也可以在随后的分析中设置。gydF4y2Ba

门控和分析gydF4y2Ba

一旦补偿设置，每个标记可以通过从每个荧光检测通道收集数据进行分析。可以对感兴趣的总体执行额外的门控，以关注特定参数的存在与否。密度图和直方图都可以用于此目的。gydF4y2Ba

图5:gydF4y2Ba密度图和直方图的表示。gydF4y2Ba

密度图gydF4y2Ba将单个细胞显示为根据其荧光特性分布的点。颜色用于表示分析中具有这些特征的单元格数量。可以同时看到两个标记，一个在x轴上，一个在y轴上，根据这两个参数的表达来区分细胞。gydF4y2Ba柱状图gydF4y2Ba显示单个参数，y轴显示细胞计数，x轴显示荧光强度。gydF4y2Ba

控制对于正确的门控至关重要，可以根据正控和负控进行设置。阳性对照是表达由具有感兴趣荧光团的抗体检测到的标记物的细胞样本。阴性对照可以是未染色的细胞或用同型对照染色的细胞;荧光抗体一种用荧光团标记的抗体，用于分析，针对细胞上不存在的抗原，以校正非特异性背景对于具有许多参数的较大面板，建议使用荧光- 1 (FMO)控制。这些控制包括每个流动面板的所有荧光标记减去一个，并且应该为实验中使用的每个荧光标记创建。它允许从重叠的光谱剖面中检测背景信号。gydF4y2Ba

高维数据分析gydF4y2Ba

研究参数数量的增加改变了流式细胞术数据的分析方法。每增加一个参数，数据就会获得更多维度。因此，新的分析技术已经发展起来，从这些高维数据中提取信息。例如主成分分析(PCA)，gydF4y2Ba ^6gydF4y2Ba 密度归一化事件的生成树级数分析，gydF4y2Ba ^7gydF4y2Ba t-随机邻居嵌入(tSNE)算法。gydF4y2Ba ^8gydF4y2Ba 这些算法根据细胞之间的表型相似性和差异对数据进行聚类，以进行二维分析。gydF4y2Ba

流式细胞术有哪些应用?gydF4y2Ba

流式细胞术用于细胞生物学，包括在gydF4y2Ba生物制药开发和分析gydF4y2Ba，以及更多gydF4y2Ba临床gydF4y2Ba应用程序。gydF4y2Ba

细胞生物学应用包括:gydF4y2Ba

一)gydF4y2Ba 细胞countingydF4y2BaggydF4y2Ba

B)gydF4y2Ba细胞周期分析gydF4y2Ba
C)gydF4y2Ba测量的可行性gydF4y2Ba
D)gydF4y2Ba扩散gydF4y2Ba
E)gydF4y2Ba各种细胞类型的表型和随后的细胞分选gydF4y2Ba

为gydF4y2Ba(前)临床应用gydF4y2Ba流式细胞术可用于:gydF4y2Ba

一)gydF4y2Ba 检测各种免疫细胞gydF4y2Ba ^9gydF4y2Ba
B)gydF4y2Ba评估激活免疫细胞后细胞因子的产生及其对靶细胞的潜在反应性gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba
C)gydF4y2Ba深入研究癌细胞和肿瘤微环境中的细胞gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba
D)gydF4y2Ba检测病毒感染细胞gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba
E)gydF4y2Ba在生育分析中评估精子的特征gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba
F)gydF4y2Ba监测心脏病和败血症gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}
G)gydF4y2Ba神经科学研究中的细胞特征gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba

流式细胞术的挑战和局限性gydF4y2Ba

尽管流式细胞术可以为细胞生物学和临床应用提供优势，但也有一些与该技术相关的缺点。系统中的流体很难保持一致性，细胞或碎片会造成堵塞或流速变化，从而影响分析。当分析更大的细胞，如癌细胞时，这种风险特别大。管道中的污染会导致系统堵塞和流动中断。激光对准也是必要的，以确保一致的结果，并应定期检查。其他的限制包括细胞仪可能对细胞造成损害，在分选细胞时影响分析和后续培养，以及单细胞分析无法提供组织特征的信息。最后，细胞仪的成本和操作成本，特别是高参数设备，可能很高，限制了它的使用。gydF4y2Ba

流式细胞仪的未来发展gydF4y2Ba

在过去的几十年里，该领域的主要发展已经允许在每个样品中研究的参数数量显著增加，并且减少了这些笨重机器的尺寸。在未来几年，这些发展可能会继续下去，只会增加所获得数据的复杂性，需要开发软件来标准化和验证这种分析。gydF4y2Ba

进一步发展gydF4y2Ba这一领域将允许在更广泛的范围内进行更广泛的分析，增加每个样本可分析的标记的数量，并改进数据分析方法，以允许对大样本进行详细分析。仪器尺寸的减小将使其更容易放置在实验室的工作台上，甚至可能在现场以有限的格式使用。此外，更加标准化的工作流程将降低用户错误率，并允许高通量的临床和诊断应用。自动移液，补偿设置，允许孔板自动分析可以提高流式细胞术分析的可靠性。gydF4y2Ba

术语表gydF4y2Ba

抗体gydF4y2Ba	特异性结合抗原的蛋白质，可以用荧光团或其他化学物质标记以供检测gydF4y2Ba
自发荧光gydF4y2Ba	光:细胞自然发出的光gydF4y2Ba
补偿gydF4y2Ba	去除多个探测器中溢出的荧光光谱重叠的计算gydF4y2Ba
补偿珠子gydF4y2Ba	易于结合抗体的微粒，可作为阳性对照，以确定流式细胞仪的正确设置gydF4y2Ba
密度图gydF4y2Ba	图中具有一定荧光强度的细胞的分布，其颜色反映具有这些特征的细胞的密度gydF4y2Ba
点的情节gydF4y2Ba	图中每个单元格都表示为一个点gydF4y2Ba
对比gydF4y2Ba	当两个粒子或细胞同时通过激光时gydF4y2Ba
流式细胞仪gydF4y2Ba	荧光激活细胞分选器gydF4y2Ba
荧光团gydF4y2Ba	或者荧光色素，一种在激光激发后发光的荧光化学物质gydF4y2Ba
弗兰克-蒙塔吉尼gydF4y2Ba	荧光减一个-特定的控制，留下一个完整面板的荧光团，以考虑溢出gydF4y2Ba
向前散射gydF4y2Ba	FSC;散射来自细胞的前进方向，反映细胞的大小gydF4y2Ba
选通gydF4y2Ba	根据细胞特性选择感兴趣的细胞群的过程gydF4y2Ba
柱状图gydF4y2Ba	y轴上的荧光或光散射强度与细胞数量的关系图gydF4y2Ba
同形像统计图控制gydF4y2Ba	抗体针对被分析细胞上不存在的抗原而产生的抗体，用于评估非特异性结合gydF4y2Ba
激光gydF4y2Ba	发出特定波长的光gydF4y2Ba
PBMCsgydF4y2Ba	外周血单核细胞，由淋巴细胞和单核细胞组成的外周血细胞gydF4y2Ba
光电倍增管gydF4y2Ba	PMT，一个灵敏的探测器在不同的电磁波谱范围的光gydF4y2Ba
边撒gydF4y2Ba	SSC;在激光束的90度处测量的散射度，反映了细胞的粒度或复杂性gydF4y2Ba
溢出gydF4y2Ba	一个荧光团的荧光信号在另一个荧光团的通道中测量，当两个荧光团在同一个细胞上测量时，导致假阳性信号gydF4y2Ba

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