什么是超分辨率显微镜?STED, SIM和STORM解释
显微镜是生物学研究中很有价值的工具。传统上，科学家们用电子显微镜来清楚地观察亚细胞结构，用光学显微镜来观察整个活细胞。
传统光学显微镜的局限性是分辨率定义为最小距离:两个物体之间的最小距离，在这个距离上它们可以被看作是分开的物体。由于传统光学显微镜的分辨率比电子显微镜差，科学家们无法使用这些工具看到亚细胞或亚细胞器的细节。
由于荧光显微镜技术的进步，科学家们现在可以使用荧光显微镜，荧光显微镜是一种光学显微镜，其中一种波长的光被吸收，另一种波长被忽略超分辨率显微术直接观察活的亚细胞结构和活动。
什么是超分辨率显微镜?
超分辨率显微镜(SRM)包含多种技术，可实现比传统光学显微镜更高的分辨率。
常规光学显微镜的分辨率为限制在200纳米左右由于光的衍射。在光学显微镜下，当光穿过周围的介质时，单个光点(称为荧光团)会显得模糊。模糊的大小被称为点扩散函数。当两个结构比衍射极限更接近时，它们将显示为单个模糊而不是两个独立的结构。
STED(受刺激发射/耗尽)显微图像显示一个年轻游离的海马神经元的肌动蛋白(洋红色)和微管(青色)。图片由荷兰乌得勒支大学Kapitein实验室分子与细胞生物物理学K. Jansen和E. Katrukha提供
如何超分辨率显微术工作吗?
有三种主要类型对于超分辨率显微镜，每一个都通过不同的机制工作。这些包括受激发射耗散显微镜(STED)、结构照明显微镜(SIM)和随机光学重建显微镜(STORM)/光激活定位显微镜(PALM)。
什么是激发发射耗竭(STED)显微镜?
受激发发射耗竭(STED)显微术是超分辨率显微镜的一种形式，它使用了一种称为空间图案激发的技术。在STED显微镜中，在焦平面上使用两个激光。当激发激光器和STED激光器一起使用时，有效点扩散函数(PSF)降低。PSF越低，分辨率越高。
STED激光抑制位于激发焦点附近的激发态荧光团通过一个称为受激发射的过程。图像场中心周围的甜甜圈状荧光团被抑制，而中心则没有。结果是PSF低于衍射极限。极其灵敏的单光子探测器然后从中央荧光团接收信号。
饱和结构照明显微镜(SSIM)和可逆饱和光学线性荧光跃迁(RESOLFTs)其他形式的超分辨率显微镜使用模式激励来提高分辨率。
什么是结构照明显微镜(SIM)?
结构照明显微镜(SIM)用于提高光学显微镜的空间分辨率。荧光样品被激发多次使用条纹照明模式。每次条纹的方向和位置都会改变。
这些图像通过计算机软件进行分析波纹模式．射向样品的条纹与样品产生的高频光相互作用。这种相互作用产生了第三种更容易分析的模式。使用多张图像，可以获得更多的细节，并以大约两倍于传统光学显微镜的分辨率重建图像。
SIM的好处包括:
- 活细胞成像
- 三维成像
- 厚切片成像
什么是随机光学重建显微镜(STORM)?
STORM家族的一员单分子定位显微镜技术，一次只激活或激发一小部分荧光团，减少空间重叠，并允许图像与小到5纳米决议。
STORM结合了光开关染料和低功率激活激光器，闪烁或切换从暗态或关态到发射态或开态。通过对可光转换荧光团随时间的成像，有可能确定这些分子的精确位置。STORM于2006年首次亮相，是超分辨率成像的一种新形式。
STORM成像肌动蛋白标记的海马神经元(橙色)和TIRF成像突触素标记的海马神经元(蓝色)。来源:Christophe Leterrier，神经细胞实验室，INP CNRS-Aix马赛大学，马赛，法国。
什么是dSTORM显微镜?
有两种类型的风暴．第一种类型的STORM使用激活染料和报告染料。激活染料开启荧光团，报告染料产生信号。第二种类型的风暴，直接风暴(dSTORM)，不需要活化剂染料。在dSTORM过程中，常用的荧光团可以与专门的缓冲液和激光器相结合来诱导光开关。
什么是双光子激发(TPE)?
TPE是一种光学过程，使用多光子吸收成像活样品，导致比传统共聚焦显微镜更少的光毒性。双光子显微镜使用红外激发光进一步渗透到组织中，与较长波长的激发相比，散射最小。对于荧光团的每一次激发，都吸收了两个红外光光子，并且激发被限制在一个微小的焦点体积，因此失焦荧光的贡献较小。
