设计一个简单的定量Western Blot实验

尽管western blotting是一种成熟的实验室技术，但最近它作为一种定量方法受到了批评，因为在生成和解释结果数据时必须非常小心。

最近一篇方法文章发表在生物医学研究国际并由Bio-Rad科学家共同撰写，提供了一个严格而简洁的工作流程，具体说明如何使用western blot实验产生和分析定量数据。

我们采访了论文的合著者之一，Bio-Rad的现场应用科学家Sean Taylor博士，以了解更多关于可重复性的问题以及所提出的技术是如何克服这些问题的。

AB:在定量Western Blot实验中，低重复性的问题有多大?

肖恩·泰勒(ST):现在有发表的评论[1-4]，博客文章[撤稿观察和研究门]，甚至有一个组织(研究诚信办公室(ORI))致力于评估来自西方印迹的已发表数据的质量。一些论文包含明显被篡改的数据，导致论文撤回，但也有许多文章发表时含有过量的蛋白质，得出了可能具有误导性或错误的结论。这些科学家并没有故意发表人工数据，而是简单地按照前人的教导设计了他们的western blot实验。这些科学家一代又一代传下来的方法来自这项技术的早期，当时西方印迹法仅用于检测样本中靶蛋白的存在与否。同样的技术仍被许多实验室应用，试图产生定量的western blot数据，而没有调整适当的程序和验证步骤，以获得可重复和定量的结果。

AB:这些问题仅限于重复期刊上的工作，还是也适用于同一实验室内重复的协议?

ST:这些问题既适用于复制先前发表的数据，也适用于在实验室重复同一实验之间，因为几十年前历史上应用的西方印迹技术根本不是定量的。这就像让两个有基本烹饪技能的人用同样的食材准备意大利面酱，但没有食谱，也没有测量勺，并期望最终的产品尝起来是一样的。即使一个人尝试这个任务，如果没有一些指导方针，这将是一个重大的挑战。这并不是说人们进行western blotting的方式需要大量的猜测(尽管许多沮丧的科学家会说这是事实)，只是没有发布或发表严格的方法，让研究人员试图从这项技术中产生定量数据。这导致了设计西方印迹实验和分析相关数据的方法数量大不相同，而不是使用被科学界广泛审查和接受的公认规范。

AB:你认为造成重复性差的主要因素是什么?

ST:从实验设计的角度来看，导致western blot数据重现性差的两个主要因素是:1)没有生成标准曲线来测量感兴趣的蛋白质。如果没有这个参考，就不可能确保在线性动态检测范围内进行定量测量。2)该程序很长，有许多步骤，在实验室之间，甚至在给定实验室中的个人之间应用不同的重点和技术，使得很难或不可能再现实验之间产生的数据。

与RT-qPCR一样，western blotting重复性差的主要原因是我们创造的一个术语“历史偏差”，即今天进行定量western blotting的科学家是从前人那里学习的。这种一代一代传递信息的方法通常是学习基本技术的极好方法，这些技术形成了我们可以在此基础上进行研究的强大知识基础。然而，当这些过去的基本技术被接受为金标准，然后在不了解其适用性和潜在后果的情况下应用于更最新或先进的设备、试剂和数据分析方法时，可能会导致意想不到的结果。使用适当的图像捕获技术是至关重要的，对于化学发光来说，这是一个基于相机的成像系统，如ChemiDoc MP。胶片绝对不推荐，我们在去年同行评审期刊《分子生物技术[5]》上发表的一篇文章中演示了胶片和基于摄像头的检测在数据质量上的差异。

此外，许多研究人员在凝胶上随机加载固定数量的蛋白质用于western blotting，通常在10ug到80ug之间，这是典型的家庭蛋白质加载控制的饱和量，导致样品之间不适当和非定量的数据归一化。它还可能导致靶蛋白在印迹上的饱和，这将给人一种感觉，即作为膜饱和的伪影，样品之间的蛋白表达没有变化。所有这些都在我们最近的文章中解释了，详细的程序，以避免这个问题，使用免染色凝胶技术。

AB:你的技术如何帮助克服这些常见的陷阱?

ST:论文中总结的技术详细描述了定量western blotting实验中从样品制备到数据分析的众多步骤的逐步方法。从本质上讲，我们已经编写了一个配方，以帮助确保所得到的western blot数据在blot和实验之间是可重复和定量的。对于RT-qPCR, MIQE指南[6]和随后的文章[7]发表，以帮助科学家从这项技术中获得可靠和可重复的数据，自那以来已被引用超过2000次。对于定量的西方印迹，目前还没有这样的官方指南，所以我们试图用这篇文章来纠正这个问题。

AB:你认为让研究人员遵循建议的步骤是迈向标准化Western Blot工作流程的一步吗?

ST:结合我们之前的论文[5]，写这篇文章的目的当然是为定量Western Blotting提供一个明确的指南。这两篇文章加起来已被下载超过两千次，而定义方法论论文的视频(http://youtu.be/q0T_Af7khHw)结合这篇文章(http://youtu.be/iCgmeufGM2g)在短短9个月的时间里被浏览了3000多次。这无疑表明全球科学家需要这类信息，他们正试图从他们的西方印迹中产生可靠和可重复的数据。

肖恩·泰勒接受了技术网络执行编辑阿什利·博德的采访。188金宝搏备用你可以找到阿什利谷歌+并关注科技网络188金宝搏备用推特．

1.萨夫拉，2004。什么时候大家都变得这么淘气了?j .中国。投资,113:1072。
2.罗斯纳，M. 2006。如何防范形象造假。科学家。20:24。
3.罗斯纳，M.和山田，K.M. 2004。图片里有什么?图像处理的诱惑。《细胞生物学》杂志，166:11-15。
4.Adam Marcus和Ivan Oransky，《我们能相信Western Blots吗?》，《实验室时代》，2-2012,41
5.Taylor SC, Berkelman T, Yadav G, Hammond M.一种可靠的定量Western blot数据的方法。Mol生物技术，2013 11月;55(3):217-26。
6.Bustin SA等人。MIQE指南:定量实时PCR实验发表的最少信息。临床化学杂志2009年4月;55(4):611-22。
7.Taylor SC, Mrkusich EM. RT-quantitative PCR的现状:对定量实时PCR实验(MIQE)发布的最低信息实施的第一手观察。中华微生物学杂志，2014;24(1):46-52。