配给不当
Zetasizer纳米系列可以测量颗粒大小，zeta电位和分子量。结合NIBS®技术，可以对浓缩的混浊样品进行上浆测量。然而，测量样品的zeta电位的浓度要求远低于测量尺寸。本技术说明旨在解释成功测量zeta电位的浓度限制。案例研究用于说明浓度的限制，并描述如果使用的样本浓度不合适，数据质量会发生什么变化。
Zetasizer Nano上用于zeta电位测量的光学配置如图1所示。首先，使用激光(1)作为光源照射样品内的粒子。对于zeta电位测量，该光源被分割以提供入射和参考光束。参考光束的强度是出厂设定的，通常在2500到3500kcps之间。入射的激光束穿过样品电池的中心(2)，散射光以正向角度(3)被检测到。当电场施加在整个电池上时，任何穿过测量体积的粒子都会导致检测到的光强度以依赖于粒子速度的频率波动，该信息被传递给数字信号处理器(4)和PC(5)。Zetasizer Nano软件分析检测到的数据，以获得电泳迁移率，从而获得zeta电位信息。
图1:用于zeta电位测量的Zetasizer光学配置
这种光学结构被称为外差探测。在这种操作模式下，来自样品的散射光与未散射的激光(参考光束)混合。使用衰减器(6)仔细控制参考光束与散射光的强度之比，在Nano系列中设置为10:1左右。这个衰减器改变激光的强度，从而改变散射的强度。对于散射光不多的样品，例如非常小的颗粒或低浓度的样品，必须增加检测到的散射光的量。因此，衰减器将自动允许更多的光通过样品。对于明显散射光的样品，如大颗粒或高浓度样品，衰减器自动减少通过样品的光量。
为了校正细胞壁厚度和分散剂折射的任何差异，安装了补偿光学(7)以保持最佳对齐。
当在Zetasizer Nano中开始zeta电位测量时，将测量参考光束的强度并显示在日志表中。使用衰减器调整入射光束的强度，使被检测到的散射光的强度不大于1/10th参考光束的光。例如，如果测量的参考光束强度为2600kcps，那么衰减器将调整到被检测到的散射光强度不超过260kcps。Zetasizer Nano中的衰减器有11个位置，覆盖100%到0.0003%的衰减器范围。衰减器位置与传输值的关系如表1所示。透射值是激光进入样品试管的百分比。
表1:衰减器指数与传输值之间的关系
衰减器指数 |
传输 |
1 |
0.0003 |
2 |
0.003 |
3. |
0.01 |
4 |
0.03 |
5 |
0．1 |
6 |
0.3 |
7 |
1 |
8 |
3. |
9 |
10 |
10 |
30. |
11 |
One hundred. |
zeta电位测量可接受的最小计数率设置为20kcps。如果检测到的计数率小于此值，则测量将中止。
从前面的讨论中可以看出，激光束必须穿透样品，才能检测到向前角度的散射光。因此，一般来说，zeta电位测量的样品必须是光学透明的。可测量的最小和最大样品浓度取决于以下因素:
进行测量所需的散射光的最低计数率为20kcps。因此，所需的最小浓度将取决于相对折射率(粒子和介质折射率性质的差异)和颗粒大小。粒子尺寸越大，产生的散射光越多，因此可测量的浓度就越低。例如，考虑分散的陶瓷粉末，如二氧化钛，其粒子折射率约为2.5。这种相对折射率导致了非常高水平的散射。因此，平均粒径在300nm左右的二氧化钛可测量的最低浓度可低至106% w / v。
如果相对折射率变低，比如蛋白质，最低浓度就会高得多。为了成功测量zeta电位，可能需要从蛋白质溶液中获得足够的散射，最低浓度在0.1到1% w/v之间。
最终，成功测量特定样品的zeta电位所需的最小浓度必须通过实验确定。
在Zetasizer Nano的zeta电位测量过程中，可以测量到的最大浓度是多少，这个问题并没有一个简单的答案。上述讨论的因素都必须考虑到，即粒径和多分散性和样品的光学性质。
Zetasizer Nano在Zetasizer Nano中以正向角度检测来自zeta电位测量样本的散射光。因此，激光束必须穿透样品。如果样品的浓度变得过高，那么激光束将因粒子减少被检测到的散射光而衰减。为了尝试和补偿这些影响，仪器中的衰减器位置将被调整到一个更高的指数，即更高的传输。
结果现在提出了一个案例研究，试图说明成功的zeta电位测量的浓度极限。图2显示了从一系列的zeta电位测量样品获得的结果。这是一种商用水包油乳液样品，平均粒径在220nm左右。在0.01% w/v浓度下获得的动态光散射测量的强度大小分布如图3所示。所有的zeta电位测量都是在一次性zeta电池(DTS1070)中使用通用协议在25°C进行的。手动下入40次。
图2:Zetasizer Nano自动选择的衰减器位置图，在不同的脂内浓度稀释在去离子水
图3:在0.01% w/v浓度下测量的脂质强度尺寸分布
在低浓度(0.0001% w/v)下，样品散射低水平的光，因此衰减器调整到位置11(100%传输)。随着浓度的增加，检测到更多的散射，因此为了确保散射光与参考光束强度的比例合适，选择较低的衰减器位置(较低的传输)。这种效应持续到浓度为0.05% w/v时，衰减器位置5用于测量(0.1%透射)。
当浓度大于0.05%时，激光束因其路径上的大量粒子而衰减，因此现在选择的衰减器位置开始增加，以确保检测到足够的散射。这种效应持续到浓度为1%。在此浓度下，选择的衰减器指数为11(即100%透射)。这是由于高浓度粒子对激光束的衰减很大，导致检测到低水平的散射光。
图4是图2测量的脂内样品浓度的照片。希望这能让读者了解样品可以在纳米仪器中成功测量的浑浊度。脂内样品在各种比色皿中的浓度见表2。
图4:图2中使用的不同浓度的脂内脂的照片。脂内样品浓度为:A = 0.0001% w/v, B = 0.001% w/v, C = 0.005% w/v, D = 0.01% w/v, E = 0.05% w/v, F = 0.1% w/v, G = 0.5% w/v, H = 0.75% w/v, I = 1% w/v, J = 2% w/v, K = 10% w/v(整齐样品)。样品A到I的zeta电位在纳米即1% w/v浓度下成功测量。
表2:图4所示的各种比色皿中所含样品的脂内浓度
电池标签 |
脂内浓度(% w/v) |
一个 |
0.0001 |
B |
0.001 |
C |
0.005 |
D |
0.01 |
E |
0.05 |
F |
0．1 |
G |
0．5 |
H |
０．７５ |
我 |
1 |
J |
2 |
K |
10 |
下一节将讨论不适当的样本浓度对从测量中获得的数据质量的影响。
样品A到I的平均zeta电位在纳米即1% w/v浓度下成功测量。平均zeta电位是由相分析光散射确定的，关于这项技术的进一步信息可以从Malvern Instruments网站上获得。
图5显示了从样品I (1% w/v)的测量中获得的相位图，图6是样品J (2% w/v)的相位图。为这两个样品自动选择的衰减器指数为11(100%透射)，表明检测到的散射光强度非常低。然而，尽管用样本I得到的相图很好，但样本J得到的数据很差。当两个样本的相图被过度绘制时，数据质量的比较可以非常清楚地看到(图7)。因此，该样本可靠的平均zeta电位值的浓度上限为1% w/v。
图5:样品I测量得到的相图(1% w/v)
图6:样品J测量得到的相图(2% w/v)
图7:样本I (1% w/v)和J (2% w/v)获得的相位图的Overplot，说明了数据质量的差异
zeta电位分布是由慢场反转(SFR)部分测量过程中傅里叶变换产生的频率分布得到的。尽管平均zeta电位可以在高达1% w/v的浓度下测量，但由于检测到的光的低信噪比，在此浓度下获得的zeta电位分布非常广泛。图8是样本I (1% w/v)和G (0.5% w/v)的频率分布的重叠图。样品I的分布非常广泛，zeta电位偏差在80mV左右。这是峰值的标准偏差，表明从该测量中获得的差信噪比。样本G (0.5% w/v)的频率分布由于分布宽度窄得多，具有约10mV的ζ电位偏差。因此，为了获得良好的zeta电位分布，浓度上限为0.5% w/v。
图8:样本I (1% w/v)和G (0.5% w/v)分别得到频率分布图。
要成功测量样品的zeta电位的浓度下限和上限是不容易确定的。这是因为有几个因素决定了这些浓度限制，这些因素在本技术说明中已经讨论过。
最终，任何样品的浓度极限必须通过测量样品在不同浓度下并观察对所获得的数据质量的影响来实验确定。
总的来说，我们可以将zeta电位的浓度极限总结如下:
希望在这里提出的脂质内的案例研究提供了可以在Zetasizer纳米中测量的浓度极限的指导。
最后，在Nano软件4.10版本中提供的zeta电位质量报告中分析了相位图和频率图数据的质量
