的无可争辩的互补融合蛋白质组学实践:“自下而上”和“自上而下”的方法

今天,质谱(MS)的蛋白质组学被认为是最全面的,关键技术在生命科学,并经常利用全球的研究者提出假设和解释一系列分析,生物和临床问题。有两个主要跟踪用于识别和描述蛋白质(或“proteoforms”),这些都是女士称为“自下而上”(BUP)和“自上而下”(TDP)蛋白质组学(图1)。在向左proteoforms杰出的重建的信息片段来自小块的数据回完整的——尽管推断,和原来的格式,类似于一个拼图拼凑的部分。相反,TDP始于一个全球性的概述,然后决定个人的细节proteoforms解剖通过多层次的信息。

图1:的示意图表示两个主要跟踪在质谱用于识别和描述(一)proteoforms: (B)自下而上的蛋白质组学,信息片段的拼接重新创建原始proteoform;和(C)自上而下的蛋白质组学,为每个proteoform结构细节决定通过解剖下来许多层的信息。图片由凯莱赫的实验室,伊利诺斯州的西北大学。

困难的事实BUP和计划书

更多的技术术语,BUP蛋白质组学涉及酶消化一个样本中的所有proteoforms成小肽,现在代表的特定部分的原始蛋白质(图1 b)。这里,整个复杂的混合物进行分析一般女士肽相当可溶性,彬彬有礼的生化反应,可以轻易分离的液相色谱分析之前女士选择蛋白质片段,和最频繁,肽链分散collision-induced离解(CID)和/或高能collision-induced离解(HCD)揭示肽的氨基酸序列。测序肽相匹配的蛋白质通过比较实验MS-generated数据在网上信息决定从编译和策划蛋白质数据库,如UniProt。几个肽匹配一个蛋白质提供增加信心,确实是在原样品。

相反,计划书包括初始全球所有的完整概述proteoforms样本(图1 c)。计划书的关键区别在于,不是酶消化成肽的蛋白质。相反,完整,完整的蛋白质在一个纯粹的原始形式进行了分析。结构信息在每个proteoform然后由碎片完整蛋白质的深入研究个人proteoforms和破译的框架组成。TDP仍然需要复杂的生物样品中的蛋白质的分离,这可以通过使用传统的技术,如液相色谱或二维凝胶电泳分析女士紧随其后。碎片的完整蛋白质通过HCD等分离方法,实现电子捕获离解(ECD)和电子转换离解(等)和/或组合。

比较和对比的优缺点BUP和计划书

类似于任何基于技术分析方法,总有固有的困难和优势,延伸和计划书都不能幸免。计划书的主要好处是,完整的质量每个proteoform保留和不稳定结构特点往往毁于BUP保存。因此,一个更完整的概述和模式可以获得所有的修改网站。因此,TDP可用来检测蛋白亚型,序列变异,N和/或c端乳沟产品和其他降解产物。的方法也可以成功地识别不可预测/意想不到的转录后修饰(天车)和确定的存在多个已知的修改和组合。此外,TDP更适合识别低分子量蛋白质,经常遗漏的延伸。样品准备计划书的过程相当简单,耗时少,因为消化蛋白质肽(BUP)的基础是消除。尽管有这些明显的优势,蛋白质鉴定和proteoform TDP患有局限性特征的检测和分割更大的蛋白质,和内在的动态范围问题。计划书的另一个缺点是单个蛋白质的大规模识别在复杂样品。这仍然是限制因为可靠和简单完整的蛋白质分离方法与女士缺乏集成。

当讨论他的观点在计划书,罗马a表现怎么样教授在斯德哥尔摩的卡罗林斯卡学院的化学部门,说:“我不认为自上而下的蛋白质组学完全值得它的名字。”表现怎么样,他的特殊兴趣是化学蛋白质组学¹,任务是识别一个或多个目标蛋白质药物从成千上万的可能性,认为计划书是一个对未来的远见,并很可能继续另一个十年或二十年。

在他看来,所有主要蛋白质组的工作仍然是目前执行的重要性,在他看来,只有少数从TDP领域很好的例子,说明了方法的适用性。他说:“不幸的是,仍然没有工作标准方法,每次都和工作。”不过,他承认和欣赏计划书,因为他相信那是最好的表现在个案基础上,即。,低吞吐量的方式。

TDP相比,BUP有几个,虽然核心优势。从根本上说,向左是一个相对简单的和可靠的方法来确定任何给定的样本的蛋白质组成细胞,组织,等,支持可用仪器和软件。此外,上游分离肽比完整的蛋白质,更先进和BUP固有灵敏度高于计划书。尽管有这些关键优势,有一些缺点这广泛采用的方法。小蛋白质的特征仍然是相当具有挑战性,因为通常一个蛋白水解生成肽数量不足,无法辨识的女士,蛋白质序列覆盖仅限于肽的识别,不稳定的多功能天车往往失去了有歧义,多余的肽序列的起源。最后,信息是否蛋白亚型,N和/或c端乳沟产品,和降解产物存在于样本是被忽略的;出乎意料的天车或多个修改错过。

当被问及他的意见向左的关键优势和计划书,表现怎么样回应:“自下而上蛋白质组学。这是一个现成的产品。你购买标准仪器、软件和化学物质,可以执行像样的蛋白质组学在世界任何地方工作。”他继续说:“自上而下的优势之一是,天车入住率可以确定更准确,尤其是当多个多功能天车同时存在;然而,还没有杀手级应用摆脱这种能力。”

尼尔·凯莱赫化学教授、分子生物科学和医学西北大学补充道:“由于约40亿美元投资到BUP生态系统,蛋白质组覆盖率大大提高。这么多的人正在与延伸,现在有很多实现在空间,距离,组成蛋白质组学。这真的是一个巨大的推进,基础生物医学研究和所有这些细胞,科学和自然论文证明了这个事实。”

当被问及TDP影响了他的研究,凯莱赫回应说:“这使我们建立proteoform-resolved操作和应用它对基础和转化(临床)研究”。²然后他providesspecific例子来说明他的观点。“染色质生物学,我们绘制所有的丰富proteoforms及其多功能天车。这是另一个简单的事实:当proteoforms测量,它提供直接信息亚型和天车“化学计量”(即。,多少总池的蛋白质有天车)。这不是广受赏识,但我们每天都从中受益。”

凯莱赫同时希望强调价值的理解和分析铝电解计划书,表现怎么样表明对这一知识的渴望尚不够完备:“从生物学家和临床医生对铝的需求分析是一个数量级小于预期,这是自顶向下分析关键原因是不受欢迎的,因为它可能是。这是缺乏需求,反过来,品种推迟交货。如果这样的要求时,TDP将成为现成的产品在很短的时间内。”

主流社会接受TDP正在上升

虽然获得动力,TDP还不流行,也被广泛的采用,一般社区延伸。在过去,TDP通常是降级到个人的分析蛋白质或简单的混合物。复杂样品含有大量蛋白质被知名BUP传统分析方法。当被问及如果计划书会发现更大的观众在蛋白质组学社区,表现怎么样回答说:“最终,是的。“不过,他认为,这种飞跃普遍接受和应用,“计划书需要发现杀手级应用”。在他看来,“BUP目前有两个:(i)发现生物标志物在临床蛋白质组学;和(2)药物目标发现(化学蛋白质组学);目前需要自上而下的方法。“凯莱赫相信计划书会找到更广泛的接受,但是:“真正撼动大局,我们将受益于细胞和disease-biologists推动领域gene-specific在我们和分子的蛋白质识别和更精确的作业(即。,proteoforms) (2)。TDP一直影响私营部门更是如此——他们当然是社区的一部分,尽管通常安静合作伙伴。”

凯莱赫强调两个具体的例子,TDP证明。“定制MALDI-MS自上而下的方法来识别细菌病原体已经clinically-deployed >全球3000家医院;计量单位是细菌proteoforms。”他继续说:“虽然不是广受赏识,这是一个重要的临床成功!“凯莱赫给应用TDP在生物制药领域的另一个例子:“大量的能量进入自顶向下蛋白质分析应用到基于抗体的治疗研究;最终这将找到一个路径从下游研发QC / QA和老妈化验FDA批准的主流制药公司世界。”

是向左的融合和TDP终极答案?

当被问及未来的计划书和BUP将,表现怎么样说的结合BUP TDP绝对可以促进特定的研究领域,如。、本地抗体测序。“我们正在开发自顶向下方法测序抗体。有高效的自底向上的方法可用,但在我们看来,这必须辅之以自顶向下的分析。“他的实验室已经有一个自下而上的抗体称为聚光灯下蛋白质组学的方法^3、4;自上而下,现在开发新平台,结合在线蛋白质分离与分裂小说分段线性离子阱和离子阱质量分析器。

当被问及同样的问题时,凯莱赫回应道:“这两个之间有明显的互补性,几组正在捕捉。”他坚定地相信:“Proteoform-informed“自下而上”将特别有效,首先映射所有探测proteoforms中存在的一个系统(或甚至整个人类蛋白质组!),然后为特定亚型和天车设计化验,你现在知道系统中存在和动态。“此外,他说:“这相同做法可以应用于蛋白质生物标记物,技术准备是现在甚至比五年前。”

2012年,凯莱赫发起和推动了人类Proteoform项目⁵和的协调员财团对蛋白质组学。这些发展以来,科学界的兴趣一直在稳步增加,争取100%的序列覆盖率proteoforms和有效的人类蛋白质组序列。两个辅助这一目标的最新进展是:(i)的使用本机方式电喷射的“原生自上而下的女士”;和(2)单个离子女士(我的出现²女士)。⁶凯莱赫流露出兴奋在计划书的前景,他坚定地相信:“这些发展,我们现在可以在生物学和方法基本上任何目标在一个相当短的时间内获得有用的数据;因此开放一个新的vista的投资和预期来。”

引用

1. Saei et al。(2019)。ProTargetMiner作为功能蛋白质组签名的抗癌分子库发现。自然通讯。DOI:https://doi.org/10.1038/s41467 - 019 - 13582 - 8
2. 史密斯和凯莱赫。(2018)。Proteoforms作为下一个蛋白质组学货币。科学。DOI:https://doi.org/10.1126/science.aat1884
3. Lundstrom et al。(2017)。聚光灯下蛋白质组学:揭露隐藏的血液蛋白质组改善诊断蛋白质组学的力量。科学报告。DOI:https://doi.org/10.1038/srep41929
4. Lundstrom et al。(2019)。聚光灯Proteomics-A IgG-Enrichment表型分析方法与临床意义。国际分子科学杂志》上。DOI:https://doi.org/10.3390/ijms20092157
5. 凯莱赫。(2012)。一个细胞的人类蛋白质组计划方法。美国质谱学会杂志》上。DOI:https://doi.org/10.1007/s13361 - 012 - 0469 - 9
6. Kafader et al。(2020)。多路复用单个离子质谱提高测量proteoforms及其复合物。自然的方法年代。DOI:https://doi.org/10.1038/s41592 - 020 - 0764 - 5