一种表征SARS-CoV-2刺突蛋白聚糖的新方法

SARS-CoV-2的Spike蛋白是一种多功能分子机器，可介导病毒进入宿主细胞。因此，彻底了解这种蛋白质的生物学、结构、功能和进化，对于开发消除这种病毒的治疗和预防措施(如疫苗)至关重要。

罗德·乔克博士是牛津大学新成立的药物发现中心的质谱分析主任结构基因组学联盟)开发了一种新的基于质谱的方法来表征Spike蛋白中的聚糖。它可以使用任何液相色谱(LC)质谱仪进行，它不需要聚糖分析的专业知识，并且它利用了反相高效液相色谱(HPLC)的差分分辨能力。Chalk和他的同事们已经创建了一个数据库来共享通过采用这种方法获得的数据，并鼓励学术界和工业界使用它。

188金宝搏备用我们采访了Chalk，以了解该方法的工作原理及其在SARS-CoV-2研究和其他传染病中的应用。Chalk还讨论了在当前全球大流行的情况下研究SARS-CoV-2病毒的现实情况。

莫莉·坎贝尔(主持人):你能跟我们谈谈牛津大学结构基因组学联盟(SGC)进行的“典型”研究吗?这是如何让你研究SARS-CoV-2病毒的?

棒状粉笔(RC):8月，SGC成为了药物发现中心。这更简洁地解释了我们要做什么。我们鉴定出导致疾病的蛋白质，克隆并表达它们，然后放大并纯化它们，用x射线晶体学或冷冻电镜进行结构分析。一旦我们获得了结构，我们就会使用广泛的筛选技术来识别与它结合的潜在药物。所有这些信息，我们制造的方法和试剂都被置于公共领域，供制药公司或其他学术团体访问。我们的目标是加速寻找治疗癌症、阿尔茨海默病、心脏病等疾病的新药。因为我们有超过17年的生产数千种高质量蛋白质的经验，我们是蛋白质生产的“首选”实验室，我们是SARS-CoV-2蛋白质的自然选择。

Karen Steward (KS):请告诉我们你们开发了一种基于质谱的方法来改善SARS-CoV-2刺突蛋白的特征。

RC:我们的目标是能够识别、定位和量化使SARS-CoV2 Spike蛋白结构复杂化的无数聚糖。我们的方法依赖于生成带有单个聚糖的短肽，然后识别聚糖和肽。为了识别聚糖，我们使用了精确的质量和事实，即来自同一肽的所有聚糖通过反相HPLC具有相同的保留时间。为了识别肽，我们使用伪MS3碎片。所有这些信息都被整理在一个数据库中，该数据库现在包含了406个Spike糖肽的准确质量、保留时间和结构。这个数据库为一种更快更简单的方法铺平了道路，我们称之为质量保留时间指纹(MRTF)。这将在任何质谱(MS)实验室工作，不需要糖生物学的专业知识。用户只需进行一夜的酶消化，60分钟的液相色谱-质谱(LC-MS)运行，然后根据MRTF数据库搜索结果，得出每个Spike聚糖的位置、结构和相对强度。

你们在开发过程中遇到过什么特别的挑战吗?你们是如何克服它们的?

RC:是的。首先，我们发现胰蛋白酶产生具有多个糖基化位点的多肽。弹性蛋白酶是一个不太受欢迎的选择，但我们发现它在我们需要的地方切割，生成更短的多肽，更容易处理。接下来，我们发现尽管文献中有信息，弹性蛋白酶裂解并不是100%特异的;然而，我们发现这实际上并不妨碍我们的方法。最后，我们无法找到分离所有糖肽的色谱基质。我们发现反相能很好地分离多肽，但不能与不同的聚糖相连。我们实际上可以利用这个，因为如果我们发现不同的糖基具有相同的保留时间，我们就可以用它来识别肽，从而在Spike上定位糖基。

克斯:研究人员如何利用生成的数据研制出有效的SARS-CoV-2疫苗?

RC:任何表达Spike的人都需要知道表面聚糖在批次与批次之间或在实验室与实验室之间不会发生显著变化。这可能决定了抗Spike的内源性抗体或抗Spike的基因工程抗体是否能识别它。此外，聚糖的存在或不存在会改变Spike的物理性质(分子量、溶解度、电荷等)。

MC:除了SARS-CoV-2研究之外，这种方法还有什么其他应用?

RC:我们专门针对SARS-CoV-2 Spike开发了这种方法。然而，在其他病毒病原体如流感病毒、埃博拉病毒或HIV病毒中，以免疫入侵为目的的重度复杂糖基化是很常见的，它们的糖基化位点甚至比Spike还要多。建立质量保留时间数据库并将其用于快速糖链指纹识别的基本策略同样适用于这些蛋白质和其他蛋白质。此外，替代聚糖表征方法有显著的缺点。释放的聚糖分析不提供位置信息，基于片段的策略需要昂贵的设备和大量的专业知识，而基于精确质量的LC-MS策略容易产生大量的假阳性。我们的方法是同时使用精确的质量而且保留时间使聚糖分配迅速和自信。

MC: COVID-19全球大流行对您的研究有何影响?为开发安全有效疫苗的持续努力做出贡献，您有何感想?

RC:COVID-19疫情影响了我们研究的各个方面，几个月来，所有其他研究活动都暂停了。我和同事们自愿参加了新冠病毒的研究工作，我们都学到了新的科学知识和新的工作方法。科学家们一直非常努力地工作，我们收到了许多帮助的提议。最终，每个人都明白，所有学科的科学家都是战胜这种威胁的关键，我们最终将成功研制出成功的疫苗、药物治疗、快速诊断测试或三者兼而有之。

Rod Chalk博士与Molly Campbell和Karen Steward博士进行了交谈，他们是技术网络的科学作家。188金宝搏备用