细胞系发展促进生物治疗生产的进展

生物疗法是在活体宿主中产生的产品。对于大多数生物疗法(也简写为生物制剂)，细胞系是制造过程的基石。在生物制品中监管机构的批准，生产平台跨越细菌(例如，大肠杆菌)、酵母(例如:酿酒酵母)、昆虫和哺乳动物细胞系。在哺乳动物细胞中产生的生物制剂中，主要的平台，绝大多数，在70%左右，均在中国仓鼠卵巢内(赵)细胞为基础的系统。CHO细胞是哺乳动物宿主的主力，因为它们很容易被编码治疗性蛋白的转基因基因转染，通常是单克隆抗体。CHO细胞也以类似人类蛋白质的方式糖基化蛋白质，使其易于生产具有良好活性和适合人类的蛋白质疗法。此外，从工艺的角度来看，它们很容易以悬浮形式和高密度生长，提高了生物制剂的产量。由于CHO细胞来源于仓鼠，因此它们不太可能传播人类病毒。虽然CHO细胞处于生物治疗生产的最前沿，但也使用其他细胞系，如小鼠骨髓瘤来源的细胞系NS0线和小鼠脾脏骨髓瘤杂交瘤Sp2/0线．

此外，哺乳动物宿主细胞被用于产生广泛的治疗类别．大多数生物制剂都是蛋白质疗法，尤其是单克隆抗体．然而，也有一个快速增长的曲目非蛋白疗法哺乳动物细胞被用来制造包括多肽、核酸、碳水化合物和疫苗在内的物质。作为主要的生物制剂类，许多重点放在优化蛋白质治疗，如产量和翻译后修饰，但对其他类别的研究也在积极进行中，如碳水化合物生物制剂。

控制聚糖:工程细胞系优化碳水化合物生物学

苏珊Sharfstein他是纽约州立理工学院纳米科学与工程学院的纳米生物科学教授培养条件在哺乳动物细胞系中，细胞生理学影响治疗性蛋白质和碳水化合物的产生。她利用理性设计和“组学“工具来识别这些因素，目标是工程细胞系和培养条件，优化蛋白质和碳水化合物的治疗生产。

蛋白质疗法的制造过程首先用制造蛋白质的指令转染宿主细胞。这是一个模板化的过程，其中指令指定了产生治疗性蛋白质所需的氨基酸序列。相比之下,糖基化在美国，碳水化合物(或“糖苷”)与蛋白质或碳水化合物分子结合的形成是一个非模板化过程，由多酶生物合成途径产生。因此，糖基化导致糖蛋白或碳水化合物的不同糖形式的异质混合物。所有哺乳动物细胞，包括赵细胞，产生糖基化蛋白。然而，决定糖基化的生物合成途径目前还不完全清楚，因此很难控制由此产生的糖蛋白或碳水化合物生物制剂的异质性。

糖蛋白的效力、稳定性和血浆半衰期不同，影响糖蛋白生物制剂的疗效和剂量要求。它们的免疫原性也不同，这可能会影响患者的不良反应率。因此，人们有兴趣设计哺乳动物细胞系，以引导糖蛋白或碳水化合物生物的生产朝着最佳的糖型方向发展。的Sharfstein实验室对碳水化合物药物特别感兴趣肝素钠这是世界上使用最广泛的抗凝血药物。Sharfstein解释说:“肝素是一种屠宰场产品，就像重组DNA技术出现之前的胰岛素一样，重组DNA技术允许生产重组人胰岛素。”“我们的目标是创造一种新的模式，使碳水化合物药物生产(如肝素)达到相同的水平，在cGMP(当前良好生产规范)条件下作为生物工程产品生产。”

不幸的是，肝素主要由肥大细胞产生，而肥大细胞不适于培养。幸运的是，他们关系密切，结构相似硫酸乙酰肝素几乎在所有哺乳动物细胞中产生，包括易于扩展细胞培养的细胞，如CHO细胞和肥大细胞瘤细胞(肥大细胞的致瘤变体)。为了改变硫酸肝素的糖基化模式，有必要设计其多酶生物合成途径。为了解决这个问题，在Sharfstein参与的一项研究中，研究人员推断，对糖基化生物合成途径进行多基因操作可能会产生一种具有类似肝素抗凝血特性的硫酸肝素。在这"多路复用“基因组策略，研究小组设计了小鼠乳腺细胞瘤细胞系，以产生高硫硫酸肝素，其抗凝血活性超过药物级肝素。应用转录组分析比较肥大细胞和乳腺细胞瘤细胞中糖基化生物合成途径中酶的表达。该研究从糖基化生物合成途径中鉴定出几个关键酶，这些酶在肥大细胞中要么上调要么下调。当这些酶在乳腺细胞瘤细胞中过表达或被CRISPR/Cas 9交替敲除时，细胞产生了具有高抗凝血活性的硫酸肝素。

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“大数据”从细胞系解决生物制剂生产中的大问题

除了对细胞系进行工程改造，使其转化为有利的糖型外，Sharfstein和她的实验室还应用组学技术来提高蛋白质治疗效率。目前，在启动子的控制下，用该基因转染的宿主细胞表达一种蛋白质治疗，被扩增并用选择试剂处理。从细胞池中分离出单克隆，对其稳定性和蛋白质治疗效率进行分析，最后选择最佳克隆。因此，这是一个耗时和迭代的选择过程。虽然可行，但如果能以更系统和更有针对性的方式将增强的蛋白质治疗生产力设计到细胞系中，可能会更节省时间。

在CHO细胞系中，应用了一套组学方法，包括转录组学、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和表观基因组学，比较了在巨细胞病毒(CMV)控制下产生单克隆抗体的低产量和高产量CHO克隆。这项研究发现CHO克隆中的转录因子cAMP反应元件结合蛋白1 (CREB1)与CMV启动子相互作用，具有更高的单克隆抗体生产力。CREB1必须被磷酸化才能活化;因此，核蛋白组和磷蛋白组调控CHO细胞中重组蛋白的最终生产力。“此外，我们有大量的数据表明，低生产力克隆和高生产力克隆在能量途径和核糖体和蛋白质体活性方面存在差异，”Sharfstein讨论了研究结果。

一旦组学分析确定了影响克隆生产力的可操作目标，这些特征就可以被设计到细胞系中，以开发高产量的克隆。“理论上，我们可以利用我们的组学发现和建模来合理地设计和工程细胞系，以与生物过程的发展相结合。随着CRISPR技术的发展，敲入或剔除生物活性以产生更好、更多产的宿主细胞变得更加容易，我们预计这将成为未来细胞系发展的一个重要方面，”Sharfstein总结道。

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稳定转基因插入dhfr缺乏性CHO细胞:选择过程

劳伦斯Chasin他是哥伦比亚大学生物科学系名誉教授计算方法在他的研究中揭示了mRNA剪接的复杂机制，包括在CHO细胞中。最近，他和他的实验室一直对改造CHO细胞系以帮助选择高产克隆感兴趣。“选择过程要获得高产、稳定表达的CHO无性系可能需要很长时间和大量的劳动。它可以从将耐药基因引入正常CHO细胞或将纠正生物合成缺陷的基因引入营养不良的CHO细胞开始，”Chasin解释道。营养不良是指突变生物或细胞，如果不通过外源添加某种特定的营养物质就不能生存，正常菌株不需要这种营养物质才能生存，因为它通过生物合成途径内源性产生营养物质。一种广泛用于重组蛋白生产的CHO细胞类型特别缺乏二氢叶酸还原酶(dhfr)基因，如果不向生长介质中添加甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷(一种简称为GHT的营养混合物)，该菌株就无法存活，”Chasin继续说道。CHO细胞被转染感兴趣的基因，编码治疗性蛋白质，以及dhfr基因，两者都整合到基因组不同的位置在不同的克隆中。CHO细胞获得了在缺乏GHT的生长介质中生存的能力，稳定地结合dhfr还有我们感兴趣的基因。”

在此阶段之后，分离出表达高水平DHFR的单克隆，并伴有高水平的蛋白质兴趣，通常是因为它们含有大量的基因副本。然后选择产量最高、生长特性最好的克隆来制造治疗性蛋白质。“收益率取决于定位整合到基因组中的基因这是一个随机过程，留给机会，”Chasin解释道。“整合了多个拷贝数的基因的克隆也可以有更高的表达水平。虽然这也是一个随机过程，但用DHFR抑制剂甲氨蝶呤处理细胞可以增强拷贝数选择。有足够数量的细胞dhfr基因将合成足够的DHFR来克服抑制剂，因此将被选中，同时被选中的还有相当数量的邻近治疗性转基因。”后续选择甚至更多的拷贝dhfr基因利用了基因扩增的优势，这一现象可以在CHO细胞中自发发生。通过增加甲氨蝶呤剂量的多轮池扩增产生高产无性系。这样，克隆就有了100份以上的拷贝dhfr基因可以被分离出来。“这种策略的缺点是耗时，而且高基因拷贝数并不总是保证高水平的表达。另一种可行的方法是将可选择的基因靶向整合到基因组上的一个位点，从而实现非常高水平的基因表达，”Chasin解释说。

膜蛋白的优化表达:难表达蛋白的新工具

下载这张海报发现工具支持难以表达的蛋白质，e提高了研究人员研究膜蛋白生物学和c的能力可用于离子通道的优化和GPCR的表达。

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多营养不良CHO细胞:精明的选择方法

Chasin和他的团队最近还创建了一个multiauxotrophicCHO细胞系(CHO8A)，可用于一次性选择整合转基因的多个副本，避免了多轮选择的要求。这种方法也避免了用合成试剂或抗生素治疗细胞的需要，这是有利的。“我们敲除了一系列编码RNA和DNA的嘌呤和嘧啶构建单元生物合成途径中许多酶步骤的基因。这导致了一个营养不良的CHO细胞系，CHO8A在没有五种天然营养的情况下，他们就无法生存。”蔡辛这样描述这种新方法。“然后，我们用8个质粒共转染缺陷的CHO8A细胞，每个质粒都含有一个转基因和一个不同的拯救基因(即，编码一种被从CHO8A中敲除的嘌呤或嘧啶生物合成酶)，以及相邻的单克隆抗体轻链或重链。”

只有整合了所有8个基因的转染克隆才能在缺乏嘌呤和嘧啶的流行生长介质中存活和生长。此外，8个整合的概率会自动选择累积了高拷贝数(40-120)总质粒的转染克隆。“结果，我们发现邻近单克隆抗体基因的表达达到了与制造业中使用的水平相当的水平。这种多营养不良CHO细胞系的另一个用途是能够一次选择多达8种不同的蛋白质或蛋白质亚基。此外，这种策略也可以应用于其他细胞系，”Chasin总结他们的方法。

当被问及未来用于生物治疗生产的细胞系开发的研究方向时，Chasin回答说，目前生产力的瓶颈似乎很可能是分泌的限制。“能够显著提高分泌的宿主细胞的基因工程和选择方法应该可以降低制造成本，这是工业和社会的一个重要目标。”