细胞培养质量控制:重现性的关键

细胞培养是对在体外生物科学的研究它包括在人工环境中培养永生细胞系或原代细胞样本。这些细胞可以用作一系列不同科学研究的模型，包括分析药物或其他化合物对生长、活力和代谢的影响，或作为不同疾病的模型。它们以前经常用于初步研究在活的有机体内进行了实验。

从细胞培养实验中得出的结论的有用性和适用性在很大程度上取决于进行的质量控制(QC)。适当的QC可以确保细胞系模型给出可重复的结果，并允许自信地得出结论。在细胞培养中忽视QC会使研究人员和实验室在时间和金钱上付出巨大的代价，而不能证明QC合适的实验室的数据不太可能被发表。

Nikoleta Daskoulidou博士她是位于卡迪夫的英国痴呆症研究所的研究助理，致力于了解先天免疫在阿尔茨海默病中的作用。作为她工作的一部分，Daskoulidou博士使用干细胞技术作为细胞模型。她描述了QC在她的研究中的重要性:“我认为糟糕的QC是缺乏可重复性和潜在无效研究数据的主要原因。对我来说，检测我使用的细胞的身份、纯度和表型非常重要。”Daskoulidou博士提到了她在研究中使用的一些QC方法，包括“检查特定标记物的表达(和表达水平)，并测试是否存在潜在的三体症。”这对她研究阿尔茨海默病编码序列变异的研究尤其重要。

本文将概述细胞培养中QC的四个主要方面，并描述它们是什么以及为什么我们应该实施它们。

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你的细胞系和你想的一样吗?

这听起来像是一个显而易见的问题，但不幸的是，作为研究人员，这并不是我们可以想当然的事情。出于多种原因，有可能使用来自不同器官的细胞;例如，肺vs胃肠道，2)来自不同的癌症类型，3)来自不同的生物体，例如小鼠上皮vs人类上皮。此外，近年来，CRISPR革命这意味着存在大量的编辑细胞系，必须密切注意以确保亲本细胞系保持分离。 ¹ 在错误的细胞系上进行实验的影响是巨大的。在体外工作是一个有缺陷但非常有用的预测效果的模型系统在活的有机体内．例如，在药物筛选过程中，如果使用了错误识别的细胞系，结果对进一步实验的适用性就会受到影响。这可能会浪费资源，如果使用了不合适的化合物，也有潜在的危险在活的有机体内研究。根据Clara Forrer Charlier博士巴西里约热内卢里约热内卢大学的博士后研究员说，STR分型“对结果的可重复性非常重要，是方法验证和药物发现的基础”。Forrer Charlier博士目前正在研究DNA损伤反应和基因组不稳定性对神经发育和神经退行性变的影响，她指出，尽管STR分型非常重要，但在实验室和她的实验室中，通常“做得比应该做的少”，她确保“在收到细胞系后，并在多次传代后定期完成”。

据报道，在所有培养物中，不同细胞系的污染发生率约为20%。²当细胞系具有相似的表型(如形态和生长速度)时，细胞识别的问题会加剧。确定您正在培养或已接收的确切细胞类型的主要方法是STR类型。STR分型利用了包括不同个体在内的生物之间DNA的微小差异。STR;短串联重复出现在基因组中，是包含串联重复的非编码DNA的一部分。这一区域的DNA复制错误导致子DNA链重复次数增加或减少。在种群水平上，这导致在一个STR位点上有许多不同数量的串联重复。

STR类型检查不同STR位点上的重复次数。商业STR试剂盒检查16-23个位点，然后与参考数据库进行比较，以确定正在测试的细胞系的身份。²匹配的可能性极低，大约为1 / 1 x 10¹⁸个人。²

STR分型的最新进展包括包含更多的基因座，整个基因组多达27个，改进了基因组区域的直接扩增，以及更快的PCR循环能力，这可以减少处理时间。尽管如此，对于细胞系鉴定，该方法扩增了淀粉原素基因和17个位点。STR类型应用的金标准是由几家不同的公司执行的，它们符合ISO 9001和ISO/IEC 17025质量标准。

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污染预防及筛选

除了确保你的细胞类型是你认为的，保持细胞培养免受污染是QC的另一个方面。这对于确保可重复和可靠的结果至关重要。细胞培养污染最常发生的是细菌，真菌和支原体．Daskoulidou博士在实验室的做法包括“每隔几周检查细胞系中潜在的支原体污染。”这对支原体尤其重要，因为它在显微镜下无法被肉眼看到，因此可能长时间不被发现。 ^3.

采取措施防止污染和筛选将最大限度地减少这对实验的负面影响。预防方法包括使用良好的细胞培养规范，包括在层流罩中工作，使用消毒试剂，使用塑料器皿和玻璃器皿，⁴所有这些都将最大限度地降低污染的风险。

筛查包括目视检查细胞生长介质颜色，定期显微镜下检查培养细胞，对于显微镜下看不到的支原体，应定期进行细胞培养检测。⁵最常见的支原体检测方法包括微生物培养、荧光染色DNA和PCR检测支原体rRNA分子。^6,7

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你的细胞培养是否正确?

一旦我们确定我们的细胞完全是我们认为的那样，并且它们没有微生物污染，QC的另一个方面是我们在实验室中生长细胞时维护细胞的方式。

传统上，细胞是在一次性塑料瓶中培养的;将一定数量的细胞放入烧瓶和生长培养基中。

根据细胞系的生长速度，在3-5天后，细胞将需要传代;去掉一些，加入新鲜的生长培养基。当重复多次(准确的次数取决于细胞类型)，但一般是15 - 30次后，应丢弃细胞，另一批解冻。⁸Daskoulidou博士评论说，当使用特定的细胞类型，如干细胞时，在她的研究诱导多能干细胞的情况下，“我确保我使用低传代细胞。”

利用这些QC方法增加了细胞对不同条件和实验做出一致反应的可能性。不能有规律地传代细胞会导致过度汇流，在烧瓶或大量的生长培养基中，对于给定的区域有太多的细胞。这可能会影响生长速度和新陈代谢，这意味着当进行实验时，细胞可能会有不同的反应。使用传代数非常高的细胞可能意味着细胞已经耗尽，正在衰老，已经开始分化，或者特定的亚群已经生长得更多并主导培养。⁹

除了这些QC实践之外，还可以对细胞进行一些检查，如:蛋白质表达、生长速度、活力、形态。如果其中任何一个被改变，细胞应被丢弃，并将较低的传代小瓶解冻。⁹

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你是否适当地储存和分享你的细胞培养物?

除了维持细胞生长，QC的细胞系存储而转移是必不可少的。这可以分解为三个需要QC的关键部分:1)冻结和解冻过程，2)存储，3)文件。

当细胞不被培养时，标准的储存方法是在液氮的蒸汽相中储存在低温容器中。

1)正确的冷冻培养基(胎牛血清(FBS)与5-10%二甲基亚砜(DMSO)))，冷冻过程应缓慢进行。这可以保护细胞不形成晶体。相反，解冻必须在水浴中迅速发生，细胞迅速转移到没有DMSO的培养基中，以避免DMSO的破坏。¹⁰

2)储存的质量控制包括适当维护液氮罐，定期补充和检查罐密封，以确保恒温和安全。¹¹这是一个很好的做法，存储几个小瓶在不同的位置，以确保整个库存不会丢失，如果一个罐受损。公司或研究机构内部的细胞系转移也可能发生，特别是在合作期间。适当的包装和转移方法以确保细胞活力不受影响是关键。

3)对于储存和转移，以及使用标准化协议，标签和文件是QC必须的。如果没有这些，就有可能得到的细胞不是我们想象的那样，浪费时间和金钱，如上所述。Forrer Charlier博士指出了知道你正在冻结的东西的身份的重要性，并评论说:“如果你正在计划一个冻结的细胞库，也建议键入STR类型。”适当的标记包括使用以下组合对单个冷冻细胞进行标记:彩色盖子、贴纸或冷冻安全标记笔，表示细胞系、接收日期、传代号以及可能已进行的任何更改或基因编辑。在追踪储存的细胞系和样本方面的最新进展包括软件解决方案，允许在虚拟冷冻室中跟踪和记录样本细节。

你们使用的试剂是标准化的吗?

细胞系可以受到上述培养和储存方式的影响，也可以受到所用试剂的影响。最重要的试剂是细胞培养基还有用来培养细胞的血清。

不同的细胞系或细胞类型需要含有不同成分的细胞培养基，但它们通常包括葡萄糖、盐、维生素、氨基酸和其他一些营养物质。此外，还需要某种类型的血清，通常是FBS。¹²

这些试剂成分的差异可以改变细胞系的生长速度、活力和其他特征，因此对这一点进行QC是必要的。细胞培养基本身直接标准化;有许多不同的公司生产和销售介质，并将进行自己的测试和灭菌。实验室和研究所也可以在内部准备介质。对于细胞培养基的制造商和供应商，将对生产的每个批次进行一系列标准化测试，包括常见污染物的筛选。供应商将提供一份分析证明，说明介质是无污染的，并且是根据配方和设定的制造协议生产的。

FBS不是生产出来的，而是收获来的。因此，它在批次之间受到更多的变化，因此需要更多的测试，以确保再现性和质量控制。¹³FBS测试的一个关键部分是确定当用不同批次生长时，细胞的行为是否有任何差异。出于这个原因，使用一批进行整套实验是可取的。

最终用户测试不同的培养基批次以确定细胞表型的任何变异性是重要的，因为不同的细胞类型对配方的微小变化具有不同的敏感性。该领域的最新进展包括更深入地检查细胞行为对培养条件的反应，包括基因组筛选，细胞蛋白质组的检查和代谢组变化的鉴定。¹⁴

质量控制一直是并且仍然是良好细胞培养实践的基础。它最大限度地减少了实验之间的可变性，并增强了生成结果的稳健性。此外，随着频率的增加，出版期刊要求研究中的QC证明，以便发表来自给定实验室的论文。细胞系认证和鉴定，污染筛选，适当的细胞培养实践，储存和使用标准化试剂都是质量控制的重要方面，应定期进行。许多进行质量控制的技术已经建立了很长时间，但是正如上面所探讨的，有一些新的发展，包括STR分型的快速实验室检测试剂盒^3.支原体筛查，追踪储存细胞株的软件¹⁵以及样本和可访问的组学筛选工具，以便随着时间的推移或对新试剂的反应对细胞进行更深入的评估。¹⁶这些新技术可以实现更准确的细胞质量检查，或增加将QC纳入常规实验室实践的方便性。

参考文献

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