FAIMS如何改变蛋白质组学的游戏规则

科学家探索蛋白质组来识别蛋白质，量化它们的表达并分析修饰。但是蛋白质组的覆盖范围和复杂性正在增加。这给传统的分析提出了独特的挑战，传统的分析依赖于耗时和劳动密集型的方法，而这些方法正在努力跟上高通量蛋白质组学不断增长的需求。然而，基于高分辨率质谱(MS)的技术可以克服这些挑战，使其成为基础、转化和生物制药实验室的首选方法。

该领域的最新进展，特别是与液相色谱(LC)和串联质谱系统相结合的差分离子迁移技术，可以在不牺牲性能的情况下实现敏感、准确、高通量的蛋白质组学分析。在这里，我们探索蛋白质组学方法和覆盖率如何受益于使用高场非对称波形离子迁移率光谱(FAIMS)耦合到高分辨率MS。

我们还研究了鸟枪蛋白质组学(也称为自下而上蛋白质组学)中不同的数据采集模式，如数据依赖模式和数据独立模式，如何影响所识别的蛋白质数量，以及它们被量化的置信度。通过古蛋白质组学领域的一个案例研究，证明了这些技术的前景，证实了它们从珍贵、罕见的样本中提供详细蛋白质鉴定的能力和潜力。

一种更有选择性，更有效的蛋白质分析方法

传统的检测和分析蛋白质的方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)或western blotting，涉及大量的手工工作，因此在效率和通量方面受到限制。这些分析也并不总是足够敏感，以检测含量较低的蛋白质。依赖这些基于抗体的方法的科学家可能难以以高通量的方式检测和量化微量蛋白质，从而限制了他们测试假设的速度。

使用LC-MS的鸟枪蛋白质组学方法为蛋白质组分析带来了急需的高通量能力。在广泛使用的“自下而上”蛋白质组学方法中，复杂的蛋白质混合物被酶分解成肽，通过色谱分离，并在质谱仪上进行分析。

为了提高选择性和提高检出限，MS可以与FAIMS结合使用。FAIMS是一种差分离子迁移技术，在强电场和弱电场存在的情况下，在空间上分离气态中的电离物种。放置在MS入口之前，只有具有特定迁移率值和稳定飞行路径的离子进入MS进行检测和测序。为了选择离子组通过界面进行质谱分析，一个次级直流电势，补偿电压(CV)，应用于内部电极。改变CV选择不同的离子组，并允许检测多个独特的前体，增加了非faims方法的覆盖范围。

相结合的FAIMS和MS工作流程比传统的免疫分析和仅涉及LC-MS的方法带来了许多好处。通过在将离子引入质谱仪之前进行在线气相分馏，该方法增加了蛋白质组的覆盖率，而无需任何额外的样品制备步骤，从而提高了生产效率。FAIMS还适用于纳米和毛细管流动应用，有助于保存珍贵的，尺寸有限的样品。在实现方面，一些现代技术提供了带有推荐参数的预构建方法模板，允许工作流无缝地插入蛋白质组学实验室，而不需要任何额外的技术专长。

数据依赖采集(DDA):提高蛋白质组覆盖率

蛋白质组学旨在高可信度地识别特定数量的蛋白质。是否实现这一点取决于方法收集数据的方法。经典的鸟枪蛋白质组学研究使用一种称为数据依赖采集(DDA)的方法获取数据，其中质谱仪分析混合物中分离的LC组分以生成MS¹扫描。在DDA中，来自MS的强度最高的前体离子¹被选中，碎片化成更小的产物离子，并在串联质谱(MS²)．来自MS的数据²然后对获取后的数据库进行搜索，以识别肽。

DDA前体选择的随机性质意味着一定百分比的可检测肽会被碎片化，通常80%的碎片离子在所有运行中共享，导致再现性差。由于只有选定的前体是碎片化的，多肽采样不足，一些蛋白质组信息丢失。这通常被称为缺失值问题，并限制了大量样品的定量精度。

在对来自单细胞类型的完整人类蛋白质组的综合分析中，使用基于ms的鸟枪蛋白质组学分析了来自HeLa细胞的~584,000个独特的肽序列(1)。为了提高DDA方法的检测限并最大化所识别的蛋白质数量，研究人员使用了多个具有多个短LC-MS梯度的样品负载。与单发方法相比，这种多发策略增加了动态范围和蛋白质组覆盖率，同时在蛋白质水平上保持了高的识别置信度，错误发现率为1%。

研究人员还尝试将FAIMS与DDA一起使用，运行CV梯度以允许不同的离子组进入质谱仪。这使得他们在给定CV下识别的蛋白质比之前的无fims工作流多30%。

数据独立采集(DIA):全面且无偏见

在数据独立采集(DIA)**中，预定义窗口中的所有分析物都被碎片化，随后在MS中进行分析²扫描。DIA方法将样品中的每一个肽片段——而不是像DDA那样只选择前体——提供了更高的可重复性。在破碎过程中，所有产生高于噪声的片段离子信号的肽都将在每次运行中得到一致的记录，大大减少了缺失值的数量。这种无偏的蛋白质分析方法使DIA成为蛋白质组发现分析的一种有前途的技术。

DIA收购MS²光谱以平行的方式，使其能够识别更多的肽前体比DDA，而不是获得MS²按顺序光谱。哥本哈根大学Jesper Olsen教授的团队进行了一项研究，比较了使用DIA和DDA方法的鸟枪蛋白质组学的性能(2)。使用相同的LC-MS²与DDA相比，DIA通常识别的多肽数量是DDA的两倍以上，同时还提供了更广泛的动态范围。

当与FAIMS结合使用时，DIA为蛋白质组学分析带来了两个世界的优点:更高的可重复性和更大的蛋白质组覆盖范围。在奥尔森实验室的一项实验中，为了测试不同方法在蛋白质组分析中的敏感性，进行了稀释系列，其中逐渐增加负载样品的浓度进行分析。DIA与FAIMS相结合，与单独的DDA或DIA相比，即使在负载样品量较低的情况下，也始终产生更高数量的定量蛋白质。例如，在装载样品5 ng时，DDA和DIA分别鉴定出26和547种蛋白质，而DIA与FAIMS鉴定出1074种蛋白质，是比较灵敏的方法。

案例研究:43000年前长毛象骨骼的蛋白质组学分析

古蛋白质组学是研究稀有化石样本来研究物种进化的领域，需要高度敏感的蛋白质组学。蛋白质在化石中保存的时间比DNA长得多，作为古老的生物标记物，提供了关于进化关系和分子系统发育推断的宝贵信息。历史上的骨骼样本不适合DNA测序，因此要接受高分辨率串联质谱(例如基于LC-FAIMS-Orbitrap质谱的方法)来识别古代蛋白质。

丹麦自然历史博物馆和诺和诺德基金会蛋白质研究中心等研究合作伙伴使用高灵敏度、高分辨率的连续质谱技术，对保存在西伯利亚永久冻土中的43000年前长毛象骨骼中提取的古代蛋白质遗骸进行了鸟枪测序(3)。

研究小组从猛犸象骨骼遗骸中鉴定出126种独特的蛋白质，其中90%之前没有通过ms测序从古代骨骼中鉴定出来。蛋白质图谱显示，细胞外基质(ECM)相关蛋白(49%)和血浆蛋白(21%)占主导地位，其余包括膜和细胞内蛋白、胶原蛋白和角蛋白。

由于序列变体的分类学定位，FAIMS技术带来了项目所需的深度蛋白质组覆盖，说明了高通量蛋白质组学平台的进步如何为进化生物学提供了新的视角。

蛋白质组学的基础和转化研究

蛋白质组学实验室正面临着日益增长的需求，这些需求可以通过将FAIMS的选择性和MS的高分辨率滚动到一个健壮的工作流程中来满足。无论最终应用是探索性的(如古蛋白质组学)，还是通过从患者样本中鉴定临床相关生物标志物的转化，这些先进的基于ms的方法带来的高通量能力能够快速筛选数百个样本，同时提高定量精度和增加蛋白质组覆盖率。

参考文献

1.快速生成综合人类蛋白质组的优化鸟枪策略https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5493283/

2.Q Exactive HF-X用于鸟枪蛋白质组学的性能评估https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jproteome.7b00602#

3.更新世猛犸象股骨的蛋白质组学分析揭示了100多种古代骨骼蛋白质https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/pr200721u

**美国目前还没有DIA方法