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什么是LC-MS, LC-MS分析和LC-MS/MS


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从药品和食品到体液和土壤,分析实验室对精确测量微克和亚微克的需求越来越大有时是在复杂的矩阵中。虽然这本身并不是一项简单的任务,但在确保数据质量的同时,尽可能快地分析数百个样本的潜在需求增加了额外的挑战。

耦合的液相色谱法(信用证)质谱分析(MS)为分析科学家提供了一个强大的工具来满足这些严格的要求。由于其通用性和效率,液相色谱-质谱(LC-MS)仪器已成为许多现代分析实验室所需要的。


LC-MS是什么?


LC-MS是一种分析技术,涉及目标化合物(或分析物)的物理分离,然后进行基于质量的检测。虽然
相对较新的,其敏感性、选择性和准确性使其成为检测微克甚至纳克数量的各种分析物的首选技术,从药物代谢物、农药和食品掺假到天然产品提取物。


LC-MS是如何工作的?


LC分离


信用证
使液体样品或固体样品的溶液中的被分析物发生物理分离。将几微升的样品溶液注入流动的溶剂流中,称为流动相。而最优注射量取决于实验条件,有可能精确地注射0.1 μ L到100 μ L的样品autosampler。1流动相被连续泵送通过一个柱(不锈钢管),通常填充有涂有另一种液体(固定相)的二氧化硅颗粒。当样品溶液-流动相混合物到达色谱柱时,其组分将根据其化学组成或物理性质与固定相(留在色谱柱中)发生差异相互作用。根据分析物与固定相相互作用的机理,将LC分离分为不同的模式,如:

-分割色谱法
-基于分析物在固定相与流动相中溶解度和疏水性的不同。

-离子交换色谱法
-根据分析物的离子电荷将其分离。

-凝胶排阻层析法
-利用分析物分子大小的差异来分离它们。

-亲和色谱法
-根据分析物与固定相结合的能力分离分析物。


一些分析物与固定相的相互作用比其他的更强,导致它们在通过色谱柱时分离。与固定相相互作用最小的分析物首先从色谱柱中析出。随着流动相继续流过色谱柱,剩余的分析物被依次排出,相互作用最强的分析物最后出现。特定分析物在色谱柱中停留的时间是该分析物的特征,称为其保留时间(RT)。


LC检测


流出色谱柱(洗脱液)的流动相通过一个探测器,该探测器对其中分析物的某种物理或化学性质(如折射率或光吸收)“做出反应”。该响应被捕获为一个信号或一个“峰值”,其强度(峰值面积或峰值高度)对应于样本中存在的成分的量。探测器“看到”被分析物的时间是它的RT。样品中化合物的身份可以通过比较其RT与已知化合物的RT来确认。虽然这不是一种准确的化合物鉴定方法,但当已知样品的一些信息时,它是有帮助的先天的


采用质谱进行LC检测


虽然种类繁多
探测器不同的技术和灵敏度已与LC相结合,用于分析不同类型的样品质谱计已成为一种选择性、灵敏和通用的检测器。


与其他检测器不同,携带分离分析物的LC洗脱液不允许流入质谱仪。当LC系统在环境压力下工作时,质谱仪在真空下工作,两者通过接口耦合。当柱洗脱液流入界面时,溶剂通过加热蒸发,分析物分子蒸发和蒸发电离.这是至关重要的一步,因为质谱仪只能探测和测量气相离子。


由于分析物离子是在界面的大气压下产生的,这个过程被称为大气压电离(API),该界面被称为API源。电喷雾电离(ESI)和常压化学电离(APCI)是LC-MS分析中最常用的来源。


分析物离子被吸入
质谱计它们受到电场和/或磁场的作用。离子的飞行路径通过改变施加的场来改变,从而确保它们的稳定性分离根据它们的质量电荷比(m/z)分离后,离子可以被收集和检测的各种质量检测器2其中最常见的是电子倍增器。当分离的离子撞击电子倍增器(dynode)表面时,二次电子被释放出来。这些二次电子通过串联的dynode被相乘。测量二次电子流动产生的放大电流,并与质谱仪中任意给定时刻的离子浓度相关(图1)。

LC-MS设置的示例示意图,显示了流动相和分析物从引入到系统,通过混合、分离和MS分析到检测的路径。

图1:
LC-MS设置的示例示意图。资料来源:Cwszot, Dagui1929, CasJu,和YassineMrabet,转载于知识共享CC0 1.0通用公共领域奉献许可证


绘制LC-MS数据


在LC-MS分析样品期间测量的离子丰度被绘制为总离子色谱图(TIC)。该图显示了分析物离子的峰值强度与其rt。此外,色谱图中的每个点都与质谱相关联。质谱描述了离子丰度与测量的m/z值(图2)。

LC-MS分析的示例输出图。LC分离的保留时间显示在第一个平面,质谱分析的质荷比显示在第二个平面,强度显示在第三个平面。

图2:
LC-MS分析的示例输出图。来源:Daniel Norena-Caro,转载于 知识共享CC0 1.0通用公共领域奉献许可证。


化合物的质谱不仅提供了母体化合物质量的信息(从其离子的m/z值),而且还有助于从化合物的相对丰度来阐明化合物的结构
同位素质量峰值.分析物峰的面积用于定量。


质谱仪可以在两种模式下操作,a)扫描和b)选择离子监测(SIM)。在扫描模式下,设置为在指定的时间内检测从低m/z到高m/z值的所有离子。这种模式用于分析未知样品或当样品中存在的离子没有可用信息时。在SIM模式下工作时,质谱仪被设置为测量特定的m/z值。这是精确定量样品中已知化合物的首选操作模式。


液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)


进一步提高样品鉴定和准确定量可以实现耦合两个质量分析仪串联操作。三重四极质谱仪(QQQ或TQMS)和四极飞行时间(QTOF)是最常用的串联质谱仪。这些配置为样本分析提供了几种可能性。


TQMS由两个四极杆质量分析仪(Q1和问3.),它们被碰撞单元(q/ q .)隔开2).尽管问1和问3.作为质量分析仪在质量范围内扫描或监测特定m/z值的离子,碰撞单元用于将分离在Q1通过使它们与中性气体(如氩气、氦气或氮气)发生高能碰撞。有可能操作一个
全面质量管理四种不同的模式5(图3)即:

-前体离子扫描
-第一个四极子(Q1)在一个质量范围内进行扫描,以选择特定产物离子的前体(m/z值),然后在最后一个四极(Q3.).

-产品离子扫描
——问1设置为仅将预定义的前体(m/z)传输到碰撞单元,而Q3.在一个质量范围内扫描,以识别在实验条件下获得的碎片。

-中性损耗(NL)
-都是Q1和问3.通过扫描来识别所有前体中失去相同中性(不带电)物种而生成产物的所有前体。Q的扫描范围3.为NL值所抵消。

-选择反应监测(SRM)
-都是Q1和问3.设置为监测前体和产物离子的特定m/z值。该模式具有特异性和敏感性,是化合物定量的首选模式。TQMS可用于监测相同或不同分析物的多种前体到产品的转换。


TQMS的操作模式显示Q1, Q2和Q3的电离和选择,用于产物离子扫描,前体离子扫描,中性损失扫描和选定的反应监测。

图3:
全面质量管理体系的运作模式。


破碎取决于分子的结构和实验条件,如气体压力和碰撞能量。因此,在特定的反应条件下,将碎片图与化合物RT及其准确的质量值一起进行识别。此外,对特定片段离子的监测有助于提高检测的灵敏度,从而能够对更少量的目标化合物进行定量。


QTOF质谱仪有一个四极质量分析仪和一个由碰撞单元隔开的飞行时间质量分析仪。四极子既可以用来传输离子,也可以用来分离特定的前体离子,然后在碰撞单元中分裂。一小部分离子首先通过调制器脉冲进入TOF分析仪,随后通过施加高压加速进入高真空无场区。不同m/z值的离子在飞行管内以不同的速度运动,并彼此分离。TOF质量分析仪提供高质量分辨率,同时能够快速扫描大质量范围。


质分析


LC-MS已广泛应用于不同基质中的小分子和大分子蛋白质的分析。这项技术的一些应用例子如下:

-活性药物成分中基因毒性杂质的定量4

- 在呼气中检测12种代表特定类别兴奋剂的模型化合物,如合成代谢剂和模拟剂5

-量化生物体液中的药物代谢物

-检测食品原料中的掺假物质6膳食补充剂7

-确定制革厂沉积物中的烷基苯酚乙氧基酯(APEOs)8

-泳池及河水样本中个人护理产品的定量9

-细菌细胞中核苷酸及其衍生物的定量10

的量化蛋白质组

-作为一种快速测定SARS-CoV-2检测11


该技术也被用于分析饮用水石油化工产品土壤生物制药食物而且,并检测单氟烷基物质和多氟烷基物质而且农药残留。

LC-MS的优点和局限性


的优势


LC-MS适用于极性和非极性化合物的分析
热不稳定的分子。这些化合物的范围从m/z值< 1000 Da的低分子质量分析物,到m/z值为> 100,000 Da的非常高分子质量蛋白质。化合物的“软电离”主要给出分子离子和同位素峰,这有助于确定分析物的准确质量和假定公式。当与碎片光谱相结合时,就有可能阐明被分析物的结构。


虽然,LC-MS分析通常需要几毫克的纯化合物,但只要1毫克就足够了。通过在SIM或SRM模式下操作MS,可以实现ng/mL甚至pg/mL范围内的检测极限。由于只有特定的离子在SRM模式下被监测,即使对存在于复杂矩阵中的分析物也实现了选择性。


限制


LC-MS仪器的拥有、操作和维护都很昂贵。运行仪器和分析数据需要专业知识。与其他分析技术相比,样品通量适中。
由于获得的光谱取决于实验条件,包括仪器类型,通过与参考光谱比较来鉴定化合物的范围是有限的。由于质谱仪是一种破坏性检测器,在处理可能不易获得或不能大量获得的样品时必须小心。LC-MS作为一种基于实验室而非现场的技术,对不稳定或活性样品的分析具有挑战性。


由于只有液体样品可以注入色谱柱,固体样品必须溶解在合适的溶剂中,或者必须从样品中提取分析物。通过液-液萃取(LLE)或固相萃取(SPE)等技术进行样品制备对于从血浆、食物和土壤等复杂样品中提取目标分析物至关重要。
12这不仅有助于提高分析的灵敏度,而且还减少了系统的污染(在下一节中讨论)。


LC-MS常见问题


虽然LC-MS为复杂矩阵中的痕量分析提供了一些优势,但必须采取一些预防措施来克服以下问题
挑战在使用这种技术时。13


污染


分析的灵敏度、选择性、再现性和分辨率受到污染物的影响,如金属离子、邻苯二甲酸盐、聚乙二醇(PEG)、滑脱剂、水和从各种来源进入系统的颗粒,如:

-试剂和溶剂
-用于制备缓冲液的水
-从玻璃器皿中浸出的化学物质
-微型离心管
-进口过滤器
-溶剂线
-仪器部件,如泵密封
-在源和碰撞池中用于洗脱液脱溶的气体
-样品本身

污染物可以通过以下方式干扰分析:

-抑制或增强源中分析物的电离
-与分析物形成加合物
-掩盖分析物峰和/或在色谱图中出现鬼峰
-使基线有噪声
-使系统和柱结垢,需要经常维护和更换部件

减少污染:

-流动相的制备应使用高纯溶剂、水和试剂。
-必须使用新制备的流动相,以尽量减少微生物污染水流动相和乙腈(ACN)聚合的机会。
-应避免使用肥皂或洗涤剂清洁玻璃器皿,因为它们很难清除,并可能在分析过程中造成干扰。
—必须使用高纯气体(例如,常用的纯度为> 95%的氮气)。
—氮气发生器必须妥善维护,当压力低于可接受水平时,必须更换气瓶。
分析物必须从样品基质和色谱参数中提取优化提高分析物峰与干扰峰的分辨能力。


基体效应


在分析生物样品时,其他样品成分可以抑制或增强源中被分析物的电离。为了尽量减少基质的影响,应将感兴趣的分析物与基质隔离。因此,样品的制备是LC-MS分析的重要前提。虽然这减少了基质效应,但很难从基质中仅提取分析物。为了防止干扰化合物的共洗脱色谱参数也可以优化.在无分析矩阵(矩阵匹配)中制备标准溶液也有助于解释矩阵效应。已知浓度的同位素标记内标准物,经历类似的电离抑制或增强,被用来补偿基质效应。


结转


在高浓度样品后的空白注射中,可能会出现被分析物峰,这是样品携带的结果。这必须通过使用清洗方案来解决,如重复空白注射、针洗和柱调节,以确保保持分析的灵敏度。


样品损失


分析物,如蛋白质和DNA,可能会由于与实验室消耗品(如微离心管的内表面)的非特异性结合而丢失。分析物的吸附影响分析的准确性和精密度。分析物的损失可以通过使用具有低表面粘附性的容器来最小化。另一种方法是添加阻断剂,最大限度地减少分析物与容器内表面的相互作用。
14


移动相位缓冲器的选择


由于在MS分析之前必须除去柱洗脱液,所以只有不在源中析出的挥发性缓冲液,如甲酸铵或乙酸铵,可以用于流动相的制备。


维护


质谱仪的定期维护必须按照预先确定的时间表进行,以确保仪器的准确性、可重复性和无故障操作,并尽量减少计划外停机时间。


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