疫苗运输和储存的挑战

2019冠状病毒病(COVID-19)大流行引起了全球对新疫苗开发过程的关注，以及冷链技术在运输和储存方面的关键作用。尽管使用了不同的疫苗开发方法，但它们都面临着一个共同的挑战——需要在低温下储存。

生物药物和疫苗对冷藏或超低温储存的需求并不新鲜，但在COVID-19大流行期间需求大幅增加。这意味着冷链行业需要迅速扩大超低冷柜等设备的生产，同时确保其可靠性，这一需求一直在持续。它还刺激了该行业的创新，消费者寻求更紧凑、能效更高的产品，以及先进的监测系统，以提醒用户温度波动。在发展中国家，冷链基础设施的挑战早于大流行，研究人员正在开创诸如太阳能冰箱帮助延长疫苗的保质期。

尽管取得了这些进展，但更稳定、无需冷藏即可运输和储存的疫苗仍然是一个关键目标，目前正在探索各种方法来实现这一目标。

疫苗储存和运输方面的创新

博士。玛丽亚Croyle美国德克萨斯大学分子药剂学和药物递送教授，正在开发可用于无冷链运输活病毒的薄膜基质。她的团队最近开始稳定腺相关病毒(AAV)，这样它就可以在不需要干冰或冷敷袋的情况下运输。¹市场上有几种食品和药物管理局(FDA)批准的AAV产品;每一种都必须冷冻储存和运输，并在解冻后8小时内给患者服用。如果它们在去诊所的路上融化了，就必须丢弃。

克罗伊尔说:“我们是第一个记录AAV载体在一个简单的信封里在美国运输的小组，没有任何冷敷袋或干冰，并且让嵌入的病毒在小鼠体内传递基因，就像新鲜制备的病毒一样。”“我们还能够在室温下将活病毒储存在薄膜中长达6个月，而不降低它们传递基因的能力。”

克罗伊尔的实验室需要克服的挑战之一是薄膜配方的粘度。克罗伊尔说:“目前用于制造薄膜基质的配方具有枫糖浆的稠度，不能轻易地通过注射器推动。”“为了解决这个问题，我们不得不修改配方，以降低粘度，但仍能在室温下稳定病毒。”不幸的是，粘性配方的稳定性更好，但这让团队了解了AAV保持稳定所需的环境。当他们将病毒稳定在粘性配方中并将其稀释到所需剂量时，稀释本身降低了粘度，使其更容易通过注射器。

他们现在计划在将该配方应用于目前正在临床测试的AAV产品之前，在更大的动物身上进行额外的测试。“这个概念不仅限于AAV载体，”Croyle说。“我们还在与合作者合作，在我们的电影中稳定基于mrna的疫苗和各种牲畜疫苗，并计划在明年建成一条试产生产线，以便我们快速批量生产电影。”

RNA疫苗的储存挑战

首个针对COVID-19的信使RNA (mRNA)疫苗的批准，为新一波基于RNA的治疗方法打开了大门。但RNA作为一种大而短暂的分子，必须完全完整才能正常工作，这使得它的稳定性成为疫苗开发人员面临的挑战。

“信使rna是不稳定的，因为大自然就是这样设计它的，”Daan Crommelin博士说乌得勒支大学例如，荷兰。“这些都是大分子，只要核苷酸链断裂一次，它们就会完全失去活性。”克伦梅林说，人们正在探索不同的解决方案来解决这个问题，他最近与人合著了一篇关于这些产品的热稳定性和储存的综述。²“一种方法是研究是否可以通过冷冻干燥和优化润湿保护剂等辅料的选择来稳定mrna -脂质-纳米颗粒(LNP)结构，或者还有另一种选择，即探索配制最终产品的替代方法”，如下文所述。

冷冻干燥法，即冻干法，在技术上是一个具有挑战性的过程，但它是RNA治疗领域的公司争相追求的一种方法。肯尼斯·简瑞典卡罗林斯卡学院细胞和分子生物学教授，Moderna联合创始人和eTheRNA董事会成员，他说，冻干复杂mRNA分子的能力已经存在，他希望看到这项新技术适用于所有开发mRNA疗法的人，引领疫苗和RNA疗法的新浪潮。“在流感大流行期间，由于目前的冷链要求，你需要将疫苗送到不同的地方，这对冻干的需求很明显，但我们也看到了对罕见疾病的需求，制造商将需要生产更大批量的产品并储存起来，因为患者分布在世界各地。”

优化LNPs的存储

当社区等待冻干解决方案时，在欧文实验室麻省理工学院金伯杰博士她为她的学生想出了一个暑期项目的想法，最终为优化LNP存储提供了一些关键的见解。^3.

她解释说:“我们试图找到一种有效的方法来储存我们在实验室中制作的RNA疫苗，因为我们必须不断地为我们的研究制作新鲜的RNA疫苗，有时实验的时间不合适。”“我们还需要将疫苗运送到其他设施进行实验，所以我们需要一种经过验证的方法来存储颗粒。恰好在我们启动这个项目后不久，大流行就袭击了我们，我们最终得出了一些非常及时和重要的结果。”

他们系统地改变了已知的重要参数:储存温度、冷冻保护剂的浓度和缓冲液的类型，然后将不同储存条件下疫苗引发的免疫反应与新鲜制备的疫苗LNPs进行比较。“我们发现，对于我们在实验室制作的特定的LNP-RNA疫苗，将颗粒存储在10% w/v蔗糖中，与磷酸盐缓冲盐水和-20°C是最佳方法，储存温度是最主要的因素，”Kim解释说。这验证了COVID-19 mRNA疫苗的结果，但也揭示了其他重要的见解。“我们意识到，仅仅观察储存前后颗粒的大小并不能很好地反映疫苗的功能，因为即使颗粒的结构完整性仍然存在，也可能会发生RNA泄漏或降解。”

除了mRNA, Kim和同事们还利用自我复制或自我放大的RNA进行了这项工作，这种RNA一旦进入体内就会自我复制，放大编码蛋白质的产生。这些RNA分子大约比典型的mRNA序列长10倍。“我们发现，mRNA和自我复制rna在存储特性上存在一些差异，在-80℃时最明显°C，”金说。“而装载mrna的LNPs在-80℃下储存得很好°C，自我复制的装载rna的LNPs灾难性地聚集。”研究小组认为，这可能与脂质如何与RNA组合和组织的差异有关，虽然目前还没有一种很好的技术来研究LPN的内部结构，但他们热衷于进一步研究这一现象。

其他提高热稳定性的方法

另一种解决RNA热稳定性问题的方法是将两种主要成分就地混合——一个小瓶中是mRNA，另一个小瓶中是载体系统。克伦默林说:“如果你用带正电的胶体系统，它渴望接收mRNA，那么它可以在床边混合。”“对于针对患者的癌症疫苗来说，这是一个特别好的选择，因为否则你必须在每个患者每次需要时都为他们制作LNPs，这使得它更加费力、昂贵和浪费。根据需要将它们混合起来更容易。”

的进入高级保健研究所(ahi)是一家专注于全球健康的非营利生物技术研究机构，该机构将这种载体概念向前推进了一步，创造了一种抗COVID-19的自我放大RNA疫苗，这种疫苗可以冷冻干燥，在室温下至少稳定6个月，在冷藏下至少稳定10个月。⁴该疫苗使用了一种纳米结构脂质载体(NLC)，该载体最初被开发用于运送寨卡病毒疫苗。⁵载体与自我放大的RNA混合，然后立即使用或冷冻干燥。4 .冷冻干燥后贮存°C或25°C疫苗仍然能够引起免疫反应——产生针对SARS-CoV-2的特定小鼠IgG抗体——达到与新混合疫苗相当的水平。

“我们专注于疫苗科学的实用和可能不那么迷人的一面，”他说艾米丽·福格特博士ahi的首席科学家、该研究的主要作者说:“我们在大流行之前意识到，虽然RNA疫苗对大流行应对有重大好处，但重大缺陷——特别是其制造和稳定性的复杂性——将导致它们难以在全球范围内制造和分发。因此，我们专注于开发一种更简单、有效、稳定的RNA疫苗技术，应用于Covid。”这种疫苗目前正在南非进行临床试验，在世界各地现有的疫苗生产设施生产这种疫苗很容易，不需要专门的设备。福格特补充说:“我们这个平台的目标是将我们的疫苗产品提供给需要它们的人，以应对这次和下一次大流行，同时考虑到成本和稳定性。”

展望未来

为了真正释放mRNA和其他RNA疫苗的潜力，制造它们的技术需要在全球范围内更广泛地使用，以减轻冷链的负担。“更有可能的是，疫苗将在大流行开始的地区现场生产，”钱说。“我的预测是，我们将看到中国、东南亚和非洲的生产设施如雨后春笋般涌现，因为制造GMP级mRNA的能力将更快、更便宜、更广泛。”

尽管这些设施仍然需要冷藏链来运输和储存疫苗成分，但通过自动化，整个生产过程也可能更加高效。例如，世界卫生组织一直在为GMP设施研制自动化桌面装置，用户可以在其中即插即用疫苗组件。“这种方法并不适用于所有的mRNA药物和疫苗，但我确实认为，随着酶、RNA模板和修饰核苷酸的成本在几年内下降，制造mRNA疫苗的过程很快就会像抗体和其他重组蛋白的生产一样成为常规。这是一个快速发展的领域，是生物学中发展最快的领域之一。”

参考文献

1.Doan TNK, Le MD, Bajrovic I，等。热稳定性和在活的有机体内AAV9在薄膜矩阵中的性能。Commun地中海.2022; 2(1): 148。doi: 10.1038 / s43856 - 022 - 00212 - 6

2.Blenke EO， Örnskov E, Schöneich C，等。mRNA疫苗和疗法的储存和使用稳定性:不是一个冷案例。JPharmSci．2022; 0(0)。doi:10.1016 / j.xphs.2022.11.001

3.李志强，李志强，等。脂质纳米颗粒自复制RNA疫苗贮存条件的优化。J控制释放．2023; 353:241 - 253。doi:10.1016 / j.jconrel.2022.11.022

4.Voigt EA, Gerhardt A, Hanson D，等。一种具有长期室温稳定性的抗COVID-19自我扩增RNA疫苗。npj疫苗．2022年,7(1):1-13。doi:10.1038 / s41541 - 022 - 00549 - y

5.张志刚，张志刚，张志刚，等。用于传递复制病毒RNA的纳米结构脂质载体提供了针对寨卡病毒的单一低剂量保护。摩尔其他．2018; 26(10): 2507 - 2522。doi:10.1016 / j.ymthe.2018.07.010