液滴数字PCR提供精确的量化门店库
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弗雷德哈钦森癌症研究中心最近发表了一篇文章演示人员可以使用滴数字PCR来更准确地量化门店库——提高效率和吞吐量,同时降低成本。
这里,我们赶上了博士乔治Karlin-Neumann Bio-Rad实验室和杰森biela弗雷德哈钦森癌症研究中心的找出这种技术被用于精确量化的全部潜力的下一代测序图书馆进行科学研究。
主任乔治博士Karlin-Neumann科学事务中,数字生物学中心、Bio-Rad实验室(在美国,CA)
TN:你能告诉我更多关于QX100滴数字PCR (ddPCR)系统?
Karlin-Neumann博士:Bio-Rad QX100滴数字PCRTM系统是最简单地说一个DNA分子计算技术量化具体目标序列样本。数(或“数字化”)的起始拷贝数的DNA分子细分每个PCR反应混合成十成千上万的分区(均匀大小的水滴)液滴发生器的热循环这些端点在96孔板在标准thermocycler和计算液滴的target-containing分数的升高荧光(即积极滴)滴读者(双色滴流式细胞分析仪)。ddPCR较低浓度的具体目标,积极滴很少包含多个目标分子——阳性的数量单位体积密切接近分子浓度的反应;然而ddPCR浓度较高时,水滴会平均的5目标副本每滴,,重要的是要正确运用泊松统计确定反应的真正目标浓度。然而,数字化测量不需要绝对量化的标准曲线,相比模拟实时PCR做测量。
TN: ddPCR的关键特性,允许研究人员精确地检测线粒体DNA ?
DKN:滴数码PCR是为了准确地说,敏感和DNA可再生产地量化目标无论DNA的来源,无论是从人类基因组或线粒体DNA,细菌基因组或质粒DNA,甚至cDNA源自RNA的逆转录水滴或前液滴的形成。
一旦一个试验验证表明,感兴趣的是具体的和定量的目标(在运行条件下使用),ddPCR正确可以用来准确地量化目标以及精确量化。Bio-Rad ddPCR技术的关键特性使这些属性在于其强大的化学、仪表和信号分析。化学和微流体产生高度统一和稳定的液滴,健壮的移液,热循环和阅读。这些属性使灵敏度高(每反应好几个分子)和高精度大动态范围(~ 5日志),加上端点热循环,这允许检测和准确的定量diverse-sized(删除目标)扩增子biela实验室研究证明。重要的是,这种组合系统的鲁棒性是反映在每天一致的结果和实验室实验室,导致高重现性和易用性。
ddPCR TN:这是一个应用程序,其他应用程序可以被用于什么?
DKN:在已发表的研究,的一个常见用途QX100是罕见的序列和罕见的基因突变检测或“海里捞针”的问题,如:潜在的敏感测量前病毒的水库在根除艾滋病的努力;评估污染食品的转基因产品;(如监测移植排斥反应的液体活检研究血液中大量的移植DNA或监视癌症病人对治疗的反应通过癌基因标记DNA游离);和检测人类皮肤细胞的体细胞CNV镶嵌性。此外,搜索正在进行脑脊液生物标志物识别pre-symptomatic个人阿尔茨海默氏症的风险和在病人血清microrna的癌症生物标记。进一步领域显示出巨大的益处滴数字PCR拷贝数变异(CNV)的测量,在揭示人类基因组的multi-allelic CNV景观及其潜在的参与遗传疾病,并确定致癌CNV的个性化治疗的癌症患者。也常用进行基因表达的绝对测量,而不需要一个标准曲线。其他门店库建立和发展中使用量化和QC,挥动的验证结果(例如CNV的RNA编辑或微分heteroallelic表达式)和定相液滴的标记通过物理连接。
Jason biela代表弗雷德哈钦森癌症研究中心
TN:你已经开发出一种新的工具来准确地量化和描述新创检测事件,数字删除检测(3 d)。你能告诉我更多关于这个技术吗?
杰森·biela:线粒体DNA (mtDNA)删除已知导致神经肌肉疾病,癌症和衰老。因此,重视研究其起源、和克隆扩张表型表达的机制。此外,这些变异可能成为有价值的生物标志物早期诊断疾病。但是,没有化验,很敏感,可以准确地分析这些罕见的事件。
因此,我们建立了一个新颖的试验,称为数字删除检测(3 d),它允许DNA缺失突变的测量以前所未有的敏感性。3 d是一个三步过程,包括浓缩deletion-bearing分子,单分子基因组分割成成千上万的水滴通过液滴数字PCR直接量化,并使用大规模并行测序断点表征。
我们展示了无与伦比的吞吐量、敏感性和技术进步的3 d(1)询问超过80亿的线粒体基因组,(2)首次报道,无偏的绝对测量自发的线粒体DNA缺失,(3)建立预先存在的缺失突变的扩张是背后的主要因素与年龄相关的积累在人类大脑mtDNA删除。
TN:在当前技术3 d有什么好处?
简森-巴顿:我们的手稿中给出的工作代表显著提高检测的能力,量化和描述稀有等位基因变异或任何性质的多态性。虽然最初的效用和动机呈现在我们的手稿是罕见的检测在mtDNA缺失,分析绝不是仅限于这个应用程序。鉴于我们的分析提供了第一个真正的衡量这些突变,他们真正的效用只能现在开始确定。同样的原则用于罕见的删除事件的检测也适用于检测罕见的核变异或疾病生物标志物的检测。敏感的方法检测这些事件已经被强烈的主题研究跨越广泛的学科和应用程序。
TN:你的研究支持的假设与年龄相关的预先存在的突变是主要因素积累的线粒体DNA检测。这一发现的更广泛的影响是什么?
JB:如果衰老和疾病是由线粒体DNA缺失的积累,然后研究集中在延长人类生命应该关注防止这些事件的扩张。然而,这也意味着删除事件获得早期的水平,可能会影响/组的寿命(没有干预)的长度。因此,也防止突变事件的发病早期在生活中变得越来越重要在延长寿命。
TN:你如何看待3 d分析帮助未来的研究?
简森-巴顿:3 d试验的主要好处是,它提供了一个强大的方法来检测极其罕见的突变。线粒体是适当的细胞功能的关键,保持线粒体DNA的完整性(mtDNA)是确保线粒体功能的关键。然而,mtDNA维护的机制并不清楚,也不知道如何或何时大删除与衰老和疾病相关。Drs。肖恩·泰勒和我目前使用3 d技术来帮助我们跟踪这些突变的起源和识别关键时间成人模式集。然后我们也可以开始解决关键问题的这些缺失的扩张是否驱动器衰老和疾病,是否可以控制这一过程。
188金宝搏备用技术网络编辑团队
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