在生物技术行业,大部分的研究是针对蛋白质的结构和功能特征。新方法不断被开发来完成这一任务。光散射技术是相对较新的领域的蛋白质鉴定,但潜在的使用方法,描述它们的样品不消耗是伟大的。这一技术注意介绍领域的蛋白质,它们的组成和结构,以及大小、分子量和ζ-potential测量可以应用。
氨基酸是小分子与一个常见的结构。他们有一个中央碳连着一个氨基和一个羧基,一个氢原子,第四个功能组(R)。这官能团是可变的,正是这种变化的每个20个左右身体用来建立蛋白质氨基酸。氨基酸的基本结构如图1所示在带电和不带电的状态。两个氨基酸是图2所示的例子。
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不同官能团对氨基酸赋予他们不同的属性。例如,赖氨酸的胺组将获得或失去电荷取决于当地的环境。半胱氨酸残基硫组织可以形成共价键结合在一起di-sulphide桥梁当两个氨基酸是接近。
氨基酸加入通过债券被称为肽债券氨基酸的羧基碳和氮之间的关系。当债券的形式,一个水分子释放(图3)。
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氨基酸可以结合使用这些肽债券几乎任何链序列,随后被称为多肽。短序列的12个或20个氨基酸通常简称为肽。多肽是一个合适的序列时,规模和结构,功能的蛋白质。
一个蛋白质的功能是由其结构决定,而不是它的氨基酸序列。然而,氨基酸的序列是一个关键因素在决定最终的蛋白质的结构。没有固定的蛋白质结构中无规卷曲形成。这已经很少的规则结构,没有活动。功能蛋白有非常严格的监管结构由之间的氢键和范德华力附近氨基酸,di-sulphide半胱氨酸残基之间的桥梁,和疏水相互作用。蛋白质的结构有四个层次的复杂性。
一级结构简单介绍了多肽链的氨基酸序列。
二级结构描述了大型定期的次级架构形成蛋白质折叠。主要有两个次级架构,形成二级结构。这些都是α-helix和β-sheet。某些氨基酸序列被称为螺旋成型机(包括如甲硫氨酸、丙氨酸和亮氨酸)。它们形成紧线圈称为α-helices,可以加入了循环(短的氨基酸序列与松散的结构)。氧双键之间的氢键氨基酸和氨基四氢氨基酸一起沿着螺旋的结构。α-helix的结构如图4所示。
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α-helices形式在许多蛋白质和经常被发现膜生成蛋白质——坐在细胞膜的蛋白质。这些都是用来传递信号或跨膜离子或分子进出细胞。这些蛋白质可能有多个转移膜域。作为一个例子,g传输外部信号到细胞内。这些有规则的结构包括7 membrane-spanning螺旋。的表示如图5所示。
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β-sheets形成连续当链氨基酸多肽来看过去的彼此相反的方向(反向)作为蛋白质链折叠。氧羧基和氨基之间的氢键形成氢反对氨基酸的结构刚度。这些链连接两端循环或转。这个平面称为线性结构β-pleated表或β-sheet。图6展示了氨基酸之间的氢键和图6 b显示了“绿色荧光蛋白”β-sheets,黄色所示,每桶形式结构。
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三级结构是最后的结构,从二级结构形式。这是最终的蛋白质的三维结构。它是一个氢键和范德华力,疏水相互作用,二硫化物桥梁。
一些蛋白质只有函数当两个或两个以上的多肽链形成二聚体/三聚等,统称为低聚物。蛋白质是由相同的亚基(组件),被称为homomers,或者不同的子单元和被称为heteromers。安排由低聚物的形成被称为四级结构。例如,血红蛋白的最终结构homotetramer由四个亚单元每个本身heterotetrameric组成的2双亚基α和β(图7)。
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制造生物细胞内蛋白质的过程翻译。在这个阶段,氨基酸序列和蛋白质折叠连接在一起。这个过程是由核糖体自己部分蛋白质,转化链RNA序列(类似于DNA)成一种蛋白质的氨基酸序列。随后这个过程很多修改可以影响蛋白质的活动的发生。这些可以包括糖基化,糖链绑定到表面的蛋白质。这是经常使用的目标蛋白质在细胞内特定位置如细胞膜。磷酸化添加一个磷酸基,可以用来修改一个蛋白质的活性。多个糖基化和磷酸化网站可能出现在一个单一的蛋白质。
随着温度上升,内力,蛋白质的结构一起克服,蛋白质的展开。pH值的变化将影响di-sulphide桥形成和大量的官能团的电离状态的氨基酸可能参与内部债券。在大多数蛋白质,一旦开始这个过程,它会持续到蛋白质结构是完全丢失。蛋白质的活动也将完全消失。蛋白质说变性。这发生的点称为蛋白质的熔点。蛋白质的熔点可以用作预测将在一定条件下降低的速度有多快。
像蛋白质变性,带电离子组、疏水区域和偶极子将暴露在周围的介质。当部分变性蛋白质聚集在一起,他们会很容易相互绑定通过这些接触区域和相同的力量,团结的蛋白质结构,将蛋白质。这些债券是强大的,可以容纳许多蛋白质在组织和通常不可能没有完全变性蛋白质的分离。这个过程称为聚合。聚合显然不仅会导致损失的活动参与一个聚合的蛋白质,但制剂包含聚集是导致患者强烈的免疫反应。这些包括炎症,或者更严重的是,过敏性休克,都是不可取的,意味着聚合生产或储存过程中必须避免治疗蛋白质。
体内的蛋白质的功能非常多样。他们控制几乎所有的化学反应发生在生物体;他们作为离子转运蛋白或其他分子;他们之间以及细胞内信号局部和整个有机体;他们构建和分解其他蛋白质;他们DNA构建和分解;他们刺激和调节细胞生长和分裂。
当蛋白质反应的化学反应基板形成产品,它被称为一个酶和通常有后缀日月光半导体。有许多家庭的酶在生物和它们之间。他们可以非常相似,执行相同的功能在不同的有机体的部分,或以不同的速率。作为一个例子,这种酶一氧化氮合酶有三个亚型(家庭成员)称为内皮细胞、神经细胞和诱导。所有这三个使用基质精氨酸(一种氨基酸)和氧气和生产瓜氨酸(一种氨基酸)和一氧化氮。三个亚型存在于身体的不同部位,不同动力学,这意味着他们执行相同的反应速度不同。
身体内的其他蛋白质运输分子。回到前一个例子中,血红蛋白携带氧在血液里。一个氧分子与血红蛋白结合,使蛋白质的结构改变。这是一个叫做构象的改变是一种常见的过程中蛋白质的活动。这种结构的变化使得下一个氧气分子更容易结合诱导方便接下来的另一个变化等等。这同样适用于相反的过程作为氧解离。
g,前面所讨论的,跨细胞膜传递信号。一个信号分子结合的外部部分蛋白质。这被认为引起蛋白质构象变化的形状,使细胞的内部功能区域。这允许另一个蛋白质绑定的内陆地区开始细胞内的信号级联,导致预期的变化。
胰岛素是一种激素,一种信号蛋白的一个例子。它是由胰腺血液中葡萄糖水平上升和肝脏血液中传播,它的信号的葡萄糖和储存它。糖尿病是由于身体的损失产生足够的胰岛素的能力。通过测量自己的血糖水平和胰岛素注射,一个人可以控制自己的血糖水平。
哮喘是一种慢性炎症引起的肺部疾病。蛋白质与白细胞介素6和8调节炎症和这两个特别刺激的过程。其他如白介素1和10减少炎症。白细胞介素是细胞因子蛋白质分泌,导致其他细胞继续分裂。很多工作已经进入试图人为地调节这些蛋白质和许多其他参与炎症过程
这些只是几个例子来演示蛋白质功能的许多方面。蛋白质活动在许多系列和途径和有关活动的变化任何蛋白质有敲对这些通路的影响。许多研究人员的目标是调节人为这些途径和有益的活动。正如上面的例子所显示的,疾病常常是由于蛋白质的损失或未能正确调节这些途径及其人工监管可以用来纠正这些失败和治疗疾病。
抗体(也称为免疫球蛋白)是大型蛋白质约150 kDa参与免疫反应。他们有一个定义的结构如图8所示。分子的基地,足球俱乐部片段,总是相同的初级,二级和三级结构在给定的有机体。另一个分子的一部分,工厂片段,保持类似的形状,但大量的变异等结构,有成千上万的不同在任何生物抗体。抗体是由绑定到外国对象或抗原,如分子、细菌和病毒,在身体和有许多变体,以识别尽可能多的外国分子。任何外国专门与抗体结合的分子通过各种债券、分子识别等。这触发免疫反应导致身体摧毁外国抗原。
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抗体是广泛应用于生物技术实验室。单克隆抗体提出人工都是相同的。他们可以与像罗丹明标记,荧光分子,分子或生物素,可以发光。当他们提出反对一个特定的靶蛋白,它们可以用于目标在培养细胞特定的蛋白质。如果标记抗体,研究人员可以量化的目标蛋白结合抗体的数量。另外,细胞内的靶蛋白的位置可以确定。这是一种常见的工具在生物化学在许多不同的应用程序使用。
活性部位——这是一个底物结合酶和反应发生。
代数余子式——这是一个分子,参与酶的反应以另一种方式,也许捐赠电子反应。
共轭——一个共轭分子绑定到一个蛋白质如标签组(如荧光染料-罗丹明)。
抑制剂——一种抑制剂结合蛋白质/酶抑制其功能通过改变反应的动力学或阻止基质绑定。
离子通道离子通道是一种转移膜蛋白,形成孔隙允许特定的离子穿过细胞膜。
配位体——一个配体是一个额外的组或蛋白质分子结合。
锁和钥匙——这是指适合底物的活性部位。分子间债券持有的衬底紧密配合同样在一个钥匙孔的关键。
主题一个主题是一个子结构在一群α-helices等蛋白质。
突变体——一个蛋白质的结构改变是由于删除的一种氨基酸或其替代选择,通过实验设计或机会出现在一些疾病。
本机——一种蛋白质在其原生状态正确折叠和功能结构。
重组——一个重组蛋白是一个人为地在实验室中生产。
向量在实验室——一段DNA构造编码一种蛋白质是人工合成的。
病毒——经常使用病毒来感染培养的细胞与向量使他们制造一个特定的蛋白质。
野生型——一种蛋白质的天然un-mutated形式。
蛋白质的主要测量可以用批处理执行DLS尺寸测量。由于蛋白质有非常一致的成分和折叠成紧密的结构,水动力大小可以预见与分子量有关。Zetasizer软件有一个模型来预测蛋白质的分子量与其水动力大小由DLS。的活动和功能蛋白质正确折叠和结构密切相关。因此,活动也与蛋白质的大小直接相关。因此,大小也可以作为预测的活动。蛋白质的四级结构也可以学习。蛋白质oligomerize时,它们的大小和分子量将离散增量增加对应的不同的蛋白质。再次,通过测量蛋白质在不同条件下的低聚物的状态可以被评估。许多蛋白质依靠正确的四级结构函数,所以,水动力大小可以作为预测的活动
在极端的温度和pH值等不利条件下,蛋白质会变性。通过控制这些条件下,水力半径和测量,可以建立蛋白质的熔点。这是有关蛋白质的稳定性,可以作为预测的保质期。
蛋白质结晶是一个必要的一步阐明他们的详细的三维结构。结晶是一个艰难的过程,需要一个高度纯化蛋白在理想条件。在DLS测量,多分散性是测量样品的纯度。蛋白样品和一个非常低的多分散性表明,高纯度,所有在一个特定的寡聚蛋白质构象,其结构很好控制在这些条件下,结晶所需的。通过识别蛋白质样品最低的多分散性,研究人员可以找到最合适的结晶条件。
光散射技术是特别敏感的准备更大的分子较小的分子。增加蛋白质的大小很可能聚合形成的结果。DLS测量的敏感性意味着更大的蛋白质变性的早期阶段,导致一些聚合物的形成,将导致的变化意味着水动力的大小。因此,DLS是最敏感的技术准备检测少量的总量。
从DLS测量后,SLS测量也可以由蛋白质构成的。通常高纯度,许多蛋白质分子量的样品应该适用于批量测量使用SLS,只要已知准确浓度。通过测量散射的光线在不同浓度的样品,分子量,分散的光量成正比,可以通过创建一个德拜图计算。
第二维里系数是衡量内部分子间相互作用的一个解决方案。一个正面的值表示良好的溶解度而负面的价值表示总倾向。理想的结晶条件下,蛋白质将聚合速度非常缓慢。这将允许常规结构,因此晶体形成。裁剪2nd维里系数要小,同时保持-理论上应该导致理想的结晶条件。直线的斜率在德拜是2 x 2的阴谋nd维里系数这技术也可以用于研究结晶条件。
电动电位测量的蛋白质也是可行的,使用适当的敏感仪器如Zetasizer纳米ZSP,和一个适当的方法,比如专利技术扩散障碍。大量官能团的氨基酸可以和这些操作的组合可能带电或不带电状态的蛋白质。这将会改变根据当地环境的状况和需要注意的是,电动电位可以不同于净电荷计算基于可能带电分子中残留的状态。电荷是特别感兴趣的蛋白质化学家和ζ-potential应该能够与iso-electric关注竞争,目前确定蛋白质电荷的主要方法之一,因为它允许蛋白质保持条件远靠近它的原生状态。然而,值得注意的是,蛋白质变性的应用电场,从而使电动电位测量困难。
总的来说,ζ-potential衡量排斥力在溶液中分子间的强度。传统,这是作为样品制备的稳定性的主要指标。ζ-potential高,因此,高、分子斥力时,可以将药物或蛋白质制备稳定较长时间比类似的准备ζ-potential较低。
SEC功能添加到光散射检测器是一种极大地提高其决议。虽然DLS可以用来描述蛋白质的低聚物的状态,这是无法解决低聚物的混合物。SEC分离分子根据它们的大小使其光散射理想的合作伙伴。通过分离分子在测量之前,使用DLS或SLS,这种技术可以用来识别不同组件的混合物。
更常见的是在SLS秒。在已知浓度,测量折射率或紫外检测器,分子量可以直接相关的被分子散射的光量。这可以从粘度计结合数据,衡量粘度允许大小和一些结构方面有待确定。因此,大量的信息可以获得单个蛋白质样本使用这种方法。
SEC还增加了另一个维度总量的检测。分开的主要样本,可以进一步的描述和量化。制造商的蛋白质的解决方案通常使用交会作为净化的最后一步。证券交易委员会是用来波兰的为了删除任何样品聚合形成的样品制备。也是如此,当单个蛋白质生物样品净化。
研究蛋白质进入学术界和产业界的两组。生物化学家、生物物理学家和分子生物学家一般研究蛋白质的结构,有兴趣寡聚化以及化学反应与蛋白质有关。药理学家操纵蛋白质的活动感兴趣。他们使用其他蛋白质或药物(通常是小分子如阿司匹林)人为调节的平衡转移到正确的更改导致的疾病。
研究蛋白质活动和功能通常是由那些研究完成的蛋白质组学,包括识别、描述和调节蛋白质。
最通用的光散射仪器可用Zetasizer Nano。Zetasizer Nano ZSP已专门设计提供所需的灵敏度的大小和电动电势测量散射差材料,如蛋白质。
在工业上,大部分的工作是筛查可能的候选药物或适当的结晶条件。对于这样的高吞吐量情况,Zetasizer APS, DLS板采样技术,是最省时间和敏感DLS仪器市场上。
在早期蛋白分析研究中,蛋白质纯化,往往只能在很小的量。在这种情况下,ZetasizerμV提供了行业领先的敏感性Zetasizer范围使用卷2μl一样低。
交会应用Viscotek范围的仪器和探测器提供详细和准确的分子量信息,规模和结构的蛋白质。
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