测定蛋白质分子量使用Viscotek SEC-MALS 20连接到一个水赋予®SEC系统|莫尔文Panalytical

在这个应用程序中,我们表明,莫尔文OmniSEC软件现在可以与水赋予®的无缝交换样本序列。选择的蛋白质被用来证明蛋白质分子量的测定,寡聚和聚集状态。

介绍

生物制药药物由生物分子如蛋白质。蛋白质活动通常是由其分子量和聚集状态。光散射越来越常被用来衡量蛋白质的分子量、低聚物和聚合物。SEC-MALS是更常见的蛋白质光散射测量的实现。

莫尔文的Viscotek SEC-MALS 20是一个多角度的光散射仪器20检测角度测量的绝对分子量蛋白质和低聚物的状态。它也可以用于研究蛋白质聚合物的分子量和大小,以及分析合成和天然聚合物。

水联盟^®系统经常用于蛋白质分离和流行在整个生物制药环境,尤其是由于其强大的软件,使水域^®。增加先进的探测器大多数SEC系统通常是可能由于通用的模拟和数字设备之间的连接,可以用来传输信号但软件包通常是不相容的。

在这个应用程序中,我们表明,莫尔文OmniSEC软件现在可以与授权^®样本序列的无缝交换。这允许OmniSEC按照注射由水域SEC系统和同步数据采集。选择的蛋白质被用来证明蛋白质分子量的测定,寡聚和聚集状态。

材料和方法

的Viscotek SEC-MALS 20是连接到水域联盟^®e2695泵组成的系统,脱气器和autosampler模块和一个e2414 RI检测器(图1)。autosampler触发信号连接同步注射和数据收集。从国际扶轮国际扶轮模拟信号探测器被连接到一个模拟输入SEC-MALS 20。从射流连接列,SEC-MALS 20然后国际扶轮探测器。国际扶轮探测器是跌至去年的保护流动细胞从任何背压的增加。

水赋予^®和莫尔文OmniSEC软件都安装在同一电脑。创建样本集方法的授权^®并设置运行。从授权OmniSEC然后加载序列信息

和数据收集开始。OmniSEC然后等待注射水联盟^®注射系统和收集数据。

分离的莫尔文PLS5030交会进行列运行PBS 1毫升/分钟。这些列是硅基列的分离蛋白质。他们的高分辨率和低粒子脱落使他们的理想蛋白质光散射测量。

牛血清白蛋白(BSA)为分子量标准运行,用于探测器响应校正和标准化。两个测试蛋白质,胃蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂,溶解在流动相。胰蛋白酶抑制剂是在微波炉中加热10秒钟来刺激严重的聚合。从经验中,胃蛋白酶样品已经包含骨料的显著水平。两个样品被注入(100µL)大约2毫克/毫升的浓度。结果在OmniSEC进行分析。

图1:Viscotek SEC-MALS 20和水域联盟系统。

结果

BSA单体校准结果在规范和正确的结果证明是准确测量二聚物的分子量。测试蛋白质,胃蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂,然后测量。

图2显示了胃蛋白酶的色谱图,包含三个峰值。最良好定义的洗脱峰在9.7毫升显然是单体及其分子量被正确地测量35 kDa。早期的洗脱峰有一个非常高的和多分散的分子量和明显一些大型聚合在样本的结果。定义良好的峰值越小洗脱后单体分子量较低,结果一些退化的蛋白质。这个示例因此清楚地表明,SEC-MALS 20探测器,与水联盟^®系统可以测量单体,聚合和降解产物分子量(图2)。

图2:胃蛋白酶色谱图和表的结果。

图3显示了色谱的胰蛋白酶抑制剂,在微波炉加热诱导聚合前的测量。此示例显示的单体峰分子量测定27 kDa。有许多聚合山峰都分析作为一个高峰。这已经非常的高分子量约450 kDa,多分散的聚合物等是典型的。

图3:胰蛋白酶抑制剂色谱和结果

mal测量也可以用来衡量蛋白质聚集的分子大小(Rg)如果他们的下限尺寸测量,这是大约10纳米。这可以衡量研究散射光的角度依赖性。在这里,胃蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂总量的大小比较。胃蛋白酶的聚合物的分子量约300万Da和一个非常大的测量68纳米的大小。另一方面,胰蛋白酶抑制剂的总量约450 kDa但规模小得多的13海里。角的差异依赖图在图4中,可以清楚地显示单个数据块差不多的两个样品的分子量(10000 kDa)。尽管类似的分子量,胃蛋白酶总有测量尺寸与胰蛋白酶抑制剂相比75海里的15.5海里。