大多数生物治疗药物都是蛋白质或蛋白质衍生物，目前市场上或正在开发的最大一类生物药物是单克隆抗体(mAbs)。抗体的特殊结合性质为生物制药工业提供了机会，利用它们来调节药物相关靶分子的活性，以控制或预防疾病。
传统小分子药物和生物制药之间的一个关键区别是，后者需要以液体形式加工和交付。众所周知，蛋白质在溶液中是不稳定的，因此需要开发一种方法，使这些生物治疗分子能够在溶液中长时间地制造和储存而不降解。这就是蛋白质稳定性分析在生物治疗药物的开发和制造中被证明是非常宝贵的。
显然，实时稳定性分析是评估蛋白质在溶液中的寿命或保质期所必需的。然而，这些往往是耗时的，因此已经建立了更快的预测方法，以加速学习过程，从中可以开发稳定的生物药物配方和工艺条件。
在这些预测方法中最常见的是热展开方法，它监测蛋白质的物理性质作为温度的函数。利用这些数据，可以确定蛋白质发生构象变化时的温度，并用于比较研究。一般认为，需要较高温度才能诱导构象变化的分子具有较长的保质期或更稳定。但是，有一些重要的例外情况，将在本文后面解释。
不同候选药物在同一缓冲液中可获得展开或热稳定性谱，以比较潜在生物治疗药物在给定条件下的内在稳定性。此申请被称为“候选人选择”。
热稳定性谱可以为一系列缓冲液和共溶质中的任何候选分子生成，以帮助识别稳定/不稳定条件。典型的配方添加剂或辅料包括氨基酸、糖、多元醇、盐和洗涤剂，必须注意确保这些物质不会干扰测定。这些类型的测试通常由预/配方和工艺开发小组进行。后者旨在通过确定色谱过程的稳定加载和洗脱缓冲液以及优化病毒灭活步骤来确定将最大限度地提高生物治疗产量的纯化策略。
更定量的分析技术，如差示扫描量热法(DSC)，也用于生物相似性和可比性研究。
如前所述，假定似乎需要较高温度才能诱导构象变化的分子具有较长的保质期。然而，如果选择监测这些变化的技术对某些构象事件或化学失活过程是“盲目的”，那么这种“经验法则”可能会产生误导。这就是为什么需要仔细考虑购买您的下一个蛋白质稳定性分析平台的原因之一。
市场上有许多测量蛋白质稳定性的技术。许多制造商通过将这些仪器产生的结果与差示扫描量热法(DSC)得到的结果进行比较，证明了这些仪器产生的数据的质量。DSC是他们衡量其技术的标准，并显示了DSC数据在生物物理界的高度尊重。正是由于这个原因，DSC通常被称为“黄金标准”。
我们一位客户的一段话强调了DSC的实用性:
“DSC可能是目前可用的所有生物物理方法中最强、信息量最大和最相关的。”
Sorina Morar-Mitrica, GlaxoSmithKline博士;生物加工峰会，2012
虽然总有可能找到这些替代技术确实产生良好数据的例子，但也必须认识到，在许多情况下，它们被发现没有那么有用。由于显而易见的原因，这些例子很少被公开。
所有的供应商都使用他们自己的术语，并有不同的方式来展示他们的仪器和规范。然而，所有关于可以用来测量蛋白质稳定性的仪器的考虑都必须从了解您的特定应用需求以及产品规格和功能对它们的影响开始。
大多数蛋白质稳定性的非量热技术供应商直接将其产品定位于DSC。虽然其中一些产品在每次运行的样本消耗较低方面具有特定的优势，但这是以信息内容和可重复性为代价的。当生成的数据可能具有误导性并导致糟糕的决策时，保存样本并不是一个优势。因为模棱两可的蛋白质稳定性数据而重复大量的开发项目是非常昂贵的。
1.我是否希望能够使用该仪器来评估所有蛋白质/生物治疗候选药物的稳定性?
DSC适用于所有蛋白质的分析，无论存在色氨酸残基的数量或位置。
其他测量固有荧光的技术只是蛋白质稳定性的间接测定。他们真正测量的是蛋白质展开时色氨酸残基所处环境的极性变化。
这种方法存在许多问题。这种特殊氨基酸残基的环境变化必须能代表整个分子的展开。也就是说，色氨酸残留物需要埋藏在蛋白质的核心中，同时也存在于多结构域蛋白质的所有结构域中。在现实中，情况不太可能是这样。不包括色氨酸残留的子域的结构稳定性将不会被评估，这可能导致不正确的配方或候选选择，这将影响开发管道中的下一个部门。有些蛋白质甚至不包含色氨酸残基，因此根本不能使用本征荧光方法进行分析。
图1:生物候选物的DSC热图。这些数据显示了抗体在不同缓冲液中的热展开。剖面显示不同的肩，代表抗体的CH2, CH3和Fab区展开。由于T较高，所以选择了下面板中使用的配方条件米和下T1／2
2.我想要能够描述一个多结构域蛋白质中所有个体结构域的稳定性吗?
由于DSC具有较高的重现性，并且能够监测整个蛋白质的结构变化，因此可以用来清晰地测量单个子结构域的稳定性。有一些光谱技术生成蛋白质稳定性剖面的例子，其中包含关于子域的信息，但也有许多情况下，它们无法提供这些数据，并且对某些结构变化视而不见。这是因为色氨酸残基并没有以理想的荧光检测方式分布在整个蛋白质中;有些结构域会埋藏色氨酸残基，有些则不会。如果一种仪器对第一次转变是盲目的，因此错误地选择了一个候选或配方缓冲，因为蛋白质中发生的结构变化对用于测量它们的技术来说是不可见的，这可能是特别重要的。DSC是一种通用的、全局的、高分辨率的测量蛋白质稳定性的技术，不存在这些类型的问题。
图2:通过本征荧光检测观察到的抗体热展开。剖面没有明显的转变，因此是次优的T米的决心
使用DSC监测抗体子结构域稳定性的另一个优点是Fab结合结构域的尺寸通常比CH2和CH3结构域的尺寸大，使其更容易识别。对于大多数光谱技术，信号的振幅不是特定于域的;因此，了解哪个领域是稳定的或不稳定的远非微不足道。这对于蛋白质工程项目和候选选择尤其重要，因为了解生物的哪一部分受到影响是至关重要的。
3.我是否希望我的数据中没有可能影响结果的实验伪影?
许多低样品消耗的方法使用荧光作为蛋白质稳定性的间接测量。除了前面描述的问题外，荧光还受到某些伪影的影响;具体来说，淬火、内滤、聚集和光散射，它们通常是样品浓度的函数。这有两个重要的后果。首先，当比较不同日期和不同实验室的数据时，很难获得可重复的数据，因为确保所有的共溶质浓度相同是困难和耗时的。第二，这些工件会影响展开曲线的形状，这使得分析不同于运行，非常主观，并且需要大量的专业知识才能正确解释。
一些光谱蛋白质稳定性分析需要使用染料来监测蛋白质稳定性。这些分析与固有荧光有相同的问题，但除此之外，染料可能会影响蛋白质本身的稳定性，或者缓冲成分可能会影响染料与蛋白质相互作用的程度。这可能会导致反映染料与蛋白质相互作用的稳定性剖面进一步受到缓冲成分的干扰，而这与蛋白质稳定性本身几乎没有关系。对于稳定性谱作为间接方法用于筛选与潜在药物靶点结合的小分子的应用也是如此。
事实上，DSC是一种测量整个蛋白质稳定性的第一原理技术——一种真正的全球性技术——意味着它不受上述限制。
4.我想要可重复的数据吗?
DSC通常被称为蛋白质稳定性分析的“金标准”，因为它提供了高度可重复的数据。正是由于这个原因，DSC被用于生物相似性和生物可比性研究。DSC是最近Remicade生物仿制药Remsima成功申请批准的关键技术。另一个例子是当时在安进的一个小组的工作，他们发现DSC是识别已被氧化的生物治疗产品的最佳技术。该应用成功的原因是DSC数据的高可重复性，以及DSC可以检测到多结构域蛋白质高阶结构的细微变化。
DSC也被研究作为一种诊断工具，以确定各种形式的癌症患者。显然，DSC的再现性是这个应用的关键。以下是执行这项工作的团队首席科学家的引文，强调了他使用Malvern MicroCal vp -毛细管DSC实现的DSC数据的高可重复性:
“特别适用于运行无人看管的大样本集，并最大限度地减少人为/意外错误。”
“具有显著的扫描再现性和减少样品使用的令人印象深刻的敏感性。”
“用控制软件编程很简单。”
“通过编程定期清洗/控制扫描，易于维护和保持形状。”
Adrian Velazquez-Campoy -西班牙萨拉戈萨大学BIFI研究所
5.我想要测量我的生物制剂在大范围缓冲液或共溶质中的稳定性吗?
有些技术对兼容缓冲区和/或共溶质有非常具体的要求。圆二色性是这种局限性的一个很好的例子，因为某些缓冲液(如在配方研究中使用的缓冲液)吸收与蛋白质相同波长的光，这导致信号饱和。除此之外，即使使用非常少量的洗涤剂(配方缓冲液的常见成分)也与大多数基于荧光的技术不兼容。
DSC是一种非光谱技术，不受这些问题的影响。
6.我需要描述具有高热稳定性的蛋白质吗?
DSC是专门为适应和测量蛋白质的广泛热稳定性而设计的，可在亚环境温度和高温下工作。相比之下，光谱技术通常不能在低于20°C或高于90°C的情况下使用。热不稳定蛋白质的热变性通常发生在环境温度以下，并且很容易被光谱技术所遗漏。在光谱的另一端，尽管许多蛋白质都有一个T米或热转变中点低于90°C，通常需要20°C以上的温度，以便准确确定终点。
这意味着您需要使用DSC如果T米对任何蛋白质来说都是~70°C。
7.我想要易于分析的数据吗?
Malvern MicroCal vp -毛细管DSC采用自动分析软件，消除主观性，最大限度地减少对专业知识的要求。许多竞争技术的输出可能非常主观，难以分析。这在分析抗体等多结构域蛋白质时尤其明显。
“高吞吐量是由分析软件支持的，它易于使用，不需要更多的人工计算，因此节省了我们的时间。节省的时间确实改善了我们的工作流程。”
凯瑟琳鲍尔斯-富士Diosynth生物技术公司
8.我想检测蛋白质稳定性的细微变化吗?
DSC可以检测所有水平的蛋白质结构(一级、二级、三级和四级)的变化，并且具有极高的可重复性。这意味着DSC可以检测到T中非常小的变化米因此是高阶结构(HOS)。
最近的一个例子表明，与大范围的光谱技术相比，多结构域蛋白质的DSC热图是检测不需要的低水平(< 5%)氧化生物治疗产品的最佳方法(Arthur等(2015) J Pharm Sci, Vol 104, 1548-1554)。
9.制造商或供应商有多好?
重要的是要评估您所使用的制造商或供应商的声誉，以确保您在质量上进行投资。
DSC仪器必须使用高标准制造，并由可靠的、技术领先的公司设计，以产生出版质量或决策结果。
选择一家在开发和优化这些技术方面具有合适历史的制造商。这些公司生产的仪器具有良好的机器对机器的可变性，通常是第一个在技术及其应用方面开发创新进展的公司。他们更有可能拥有专业知识、经验和支持资源，不仅可以构建伟大的工具，还可以正确地支持它们。
10.售后服务和支持呢?
您购买的仪器只是与供应商/制造商长期关系的开始，因此从提供可接受的服务和售后支持的公司购买系统非常重要。
选择一家能够提供电话、面对面和电子邮件支持、持续培训机会、现场服务和专家级支持的公司。在您购买仪器之前，请询问所提供的支持，以便您了解一旦您的新仪器安装到实验室，您可以期待的支持的质量和深度。
一个应用/要求 |
MicroCal DSC |
圆二色性 |
内在荧光 |
外在荧光 |
所有蛋白质通用 |
是的 |
是的 |
没有 |
没有 |
对所有层次的蛋白质结构都敏感 |
是的 |
没有 |
没有 |
没有 |
定量读数与折叠材料的数量成正比 |
是的 |
是的 |
没有 |
没有 |
全球高分辨率蛋白质稳定性检测 |
是的 |
没有 |
没有 |
没有 |
蛋白质稳定性的多重指标 |
是的 |
没有 |
没有 |
没有 |
展开剖面的指纹性质 |
是的 |
没有 |
没有 |
没有 |
无光学伪影 |
是的 |
没有 |
没有 |
没有 |
高度可再生的 |
是的 |
没有 |
没有 |
没有 |
不需要染料，标签或化学添加剂 |
是的 |
是的 |
是的 |
没有 |
无缓冲和共溶质干扰 |
是的 |
没有 |
没有 |
没有 |
测量T米它高于70°C |
是的 |
没有 |
没有 |
没有 |
金标T米测量 |
是的 |
没有 |
没有 |
没有 |
上表清楚地说明了为什么DSC在整个生物制药行业被广泛使用，并被认为是蛋白质稳定性测量的“金标准”。这一论断在最近的一篇论文中得到了支持，该论文详细描述了一些业内专业人士在被要求对生物制药开发管道中关键应用技术的效用进行排名时的反应(Gabrielson和Weiss IV(2015)，《药学科学杂志》104:1240-1245)。应用范围从候选选择和配方开发到可比性和生物相似性。
很明显，DSC是评估生物制剂稳定性最普遍适用的技术。
虽然一些非光谱技术的样品消耗比DSC低，但由于固有的弱点，包括(但不限于)染料干扰、散射、内滤波、差信号/无信号和定义不明确的子域结构信息，它们通常不适合这种应用。
许多这些错误和不兼容性可能导致非常昂贵的次优决策，这将导致再开发项目和/或生物药物的不可开发性。
Malvern MicroCal DSC为每个缓冲液中的每种蛋白质提供了金标准，可重复和无伪影的稳定性数据。
