应用程序的动态光散射(DLS)蛋白质治疗配方:原理、测量和分析- 1。基本原则

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执行概要

动态光散射(DLS)是一种分析技术用于测量蛋白质配方在低聚物的粒度分布和亚微米大小范围约1海里µm 1。DLS的流行在生物制药行业是一个技术后果的工作尺寸和延长样品浓度范围宽,以及它的低容量的要求。说完这些,与应用程序的挑战仍然DLS蛋白质治疗配方是围绕着数据的解释。本系列四白皮书检查常见问题和问题周围的原则,DLS数据的测量和分析,并讨论如何最小化所需的时间,增加获取和解释的准确性DLS biotherapeutic发展过程中数据。在本系列的第一部分中,我们概述DLS的关键原则:理论,相关统计数据,反褶积算法,和强度质量变换。

动态光散射

动态光散射(DLS)是一种技术,常被用来衡量bioformulations的粒度分布。DLS已成为一个主要的技术领域内的bioformulation筛选和开发,并经常用于监测和预测蛋白质的胶体稳定配方。

布朗扩散

布朗运动是指在溶液中颗粒的随机运动。这个运动是热驱动的结果溶剂或分散剂分子的碰撞粒子的兴趣。

粒子的光散射从溶液扩散布朗运动的影响下会随时间波动(图1 -左)。在长时间的间隔,散射跟踪似乎代表的随机波动的意思。在较小的时间尺度,然而(嵌入在图1 -左),很明显,强度跟踪事实上不是随机的,而是由一系列连续的数据点。这种连续性粒子位置的物理约束的结果非常接近他们占领之前只是一个短的时间(图1右)。换句话说,在短时间尺度的粒子有足够的时间将非常远离他们的初始位置,因此,信号强度相似或“相关”。

图1:强度波动扩散粒子的解决方案(左)和位置依赖相关的散射强度(右)。

强度的相关性

强度的相关性是一个二阶统计方法测量non-randomness的程度明显随机数据集。当应用于一个时间强度跟踪,相关系数(G_τ)计算如下所示,τ是延迟时间。

通常,强度自相关系数归一化,这样G (∞) = 1。对于单色激光,这规范化实施的相关上限2 G(τ₀)和基线下限为1 G (∞)。在实践中,实验上限DLS自相关是1.9。

数字相关器在动态光散射仪器不断增加和繁殖短时间尺度测量散射强度的波动来生成样本的相关曲线。DLS-measured相关曲线的例子给出了亚微米粒子的两种解决方案如图2所示。更小、更快的传播蛋白、卵清蛋白已经腐烂的基线测量的相关曲线,表明一个完整的损失在100µs相关性,而更大更缓慢扩散二氧化硅粒子需要近1000µs之前相关。

图2:DLS测量相关曲线6 nm卵白蛋白和95纳米二氧化硅。

反褶积(拟合)算法

单分散样品单一粒径组成的集团相关曲线可以安装在一个指数形式如下表达式,给出B是基线,是振幅,D是扩散系数。散射向量(q)被定义为第二个表达式,其中n是溶剂的折射率,λ₀是真空波长的激光,θ是散射角。

水力半径(R_H)被定义为硬球体的半径,以同样的速度扩散粒子在考试。DLS, R_H计算从下面使用Stokes-Einstein测量扩散系数方程,其中k是玻尔兹曼常数,T是温度,粘度η是分散剂。

累积量或单一指数型的相关性曲线拟合程序推荐的ISO,国际标准组织。使用这种方法提取的水动力大小是一个“强度”加权平均称为Z平均大小。

而累积量算法和Z平均可用于描述一般解的特点,由多个粒度组成的多通道解决方案组,Z平均可以平庸。这些类型的样本,multi-exponential拟合的算法可以提供一个更完整的画卷的粒度分布。考虑,例如,相关图如图3所示为10毫克/毫升溶菌酶样品在100毫米氯化钠69°C。这显然相关图展览两个指数衰减:一个用于快速单体3.5海里,一个用于缓慢聚合在388海里。派生了大小分布拟合测量的相关图multi-exponential使用CONTIN算法。当单一指数累积量算法,Z平均为12.4 nm。这里明显,Z平均,而有利于援引一个平均值的目的,显然是不够给分配结果的完整描述。

图3:DLS测量结果为10毫克/毫升溶菌酶在69°C 100毫米氯化钠,推导出使用multi-exponential CONTIN算法。

强度质量变换

下的面积DLS-measured中的每个峰值强度粒度分布每个粒子的相对散射强度成正比的家庭。散射强度成正比的平方分子量(或R⁶),因此强度分布会倾向于更大的粒子大小。虽然这种行为预计,它会导致一些新DLS用户困惑。幸运的是,一个转换的体积或质量分布强度可以实现利用米氏理论,在分析物的光学特性用于规范化R6依赖的散射强度的影响。强度质量转换所需的假设包括:

1. 粒子可以建模为球体。
2. 所有的粒子都有一个等价的和均匀的密度。
3. 没有错误的强度粒度分布。

对于许多应用程序相关的生物制药,第一个2假设是合理的。第三个假设,然而,总是失败,由于不适定的自然DLS的相关图拟合技术。换句话说,不管单分散的样本是如何,DLS-measured分布总是有一个小程度的固有的多分散性,即你将永远不能达到一个乐队分布作为一个可能实现用TEM测量。因此,体积转换不应该用来报告颗粒大小,而是报告相对质量组成。

图4显示了一个比较DLS-derived强度和质量分布的卵清蛋白在PBS 79°C。两个种群大小在这个例子很明显——一个6.0 nm和其他46海里。通过强度、较大的粒子大小家庭主导分布,即使它只代表样品的总质量的6%。报告结果的测量时,适当的峰值平均尺寸报告将那些来自强度分布,用质量%值用于报告组成信息,如5.95和46.0 nm,相对质量组成,分别为93%和6%。

图4:比较DLS派生的强度和质量分布在PBS卵白蛋白79°C。

更多的阅读

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莫尔文仪器的生物科学发展倡议成立加速创新,开发、推广新技术,产品,和能力解决未满足测量需要在生物科学市场。