优化临床流式细胞仪的10个技巧

近几十年来，流式细胞术已经改变了临床免疫诊断的格局。¹这种复杂而强大的技术使用荧光团标记的抗体荧光标记细胞的各种生物标志物，然后对其进行分析，以单细胞分辨率揭示细胞群内生物标志物的分布模式。²临床流式细胞术的一个常见应用是免疫分型，它可以识别免疫细胞，以帮助诊断恶性血液病，特别是白血病和淋巴瘤。^{3 - 5}它也被用于量化DNA细胞含量，⁶在儿童淋巴细胞白血病中，^7、8这与病人的结果有关。此外，它对分析治疗反应和检测治疗后残留的恶性细胞是有用的。⁹

免疫疾病治疗是流式细胞术的另一项临床应用，它被用于识别艾滋病毒感染后CD4+和CD8+ t细胞亚群¹⁰或者用来诊断原发性免疫缺陷¹¹它可以揭示异基因骨髓或造血干细胞移植后某些免疫细胞亚群的存在。^12、13临床流式细胞术的一个新兴应用是使用荧光激活细胞分选(FACS)来收集满足某些表型标准的细胞后分析，分离干细胞用于移植或基于细胞的治疗。¹

临床流式细胞仪应用是通过经过验证的方案进行的，该方案经过精心设计，以考虑最佳的荧光团组合，以尽量减少光谱重叠，并提供足够的生物标志物来识别感兴趣的人群。此外，稀有细胞群与荧光团亮度之间的平衡确保感兴趣的群体将是可识别的。流式细胞术有几个优点，如:(i)单细胞分辨能力，能够在异质群体中识别罕见的细胞亚群，这可能对疾病诊断有重要的影响;2 (ii)多种生物标志物的同时检测，¹⁴(iii)复杂但强大的仪器仪表和软件处理包，具有一致的性能和易于数据分析，(iv)快速的样品处理，以便更快地通知治疗过程。

校准至关重要

保持流式细胞仪在良好的工作状态是很重要的。这意味着每天的仪器校准和标准化是必要的，以确保从不同天收集的数据之间的一致性，并验证机器是否处于工作状态。^2、15这可以通过对参考珠进行校准检查来完成，根据制造商的说明，在狭窄的公差范围内精心准备，珠与珠之间的变化很小。这一过程测试仪器的灵敏度和线性度，并确保珠子的平均荧光强度落在仪器中每个激光的正确目标范围内。在大多数现代流式细胞仪中，这一过程是自动化的，仪器产生所有测试参数的读数。

颜色补偿

与流式细胞术中使用的抗体结合的荧光团具有相对广泛的激发和发射谱(图1)。这导致荧光团之间的“串扰”，即旨在激发特定荧光团“a”的激光激发无意中导致“B”通道中“a”的一些信号。²颜色补偿是消除或减少这种串音的一种方法，应根据制造商的说明，将珠子与测定所使用的每个荧光团结合，再加上阴性对照。

图1所示。异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红菊酯(PE)发射谱线之间的光谱重叠说明。用于激发FITC的488 nm激光导致FITC发射溢出到PE的带通(BP)滤波器范围(蓝色箭头所示)，有助于PE通道中的信号。

考虑控制

珠粒的光学参数与免疫细胞的光学参数不同。因此，一旦执行QC，最好使用以前运行测定时的设置运行测定特定的控制。在这个阶段，可以调整光电倍增管电压(PMTV)，进行正向散射(FSC)和侧散射(SSC)，使淋巴细胞规模化。接下来，应使用以下方法进行对照:(i)未染色的阴性细胞，其应低于所有荧光通道中预先确定的阳性细胞阈值，(ii)试验中使用的每个荧光团的染色阳性对照，其应在阈值以上的范围内，以及(iii)同型抗体对照，其应低于阈值。针对每种荧光团颜色调整PMTV可用于细化阴性和阳性对照的位置。

样品的获取和处理

正确的样本处理需要将样本正确地记录到实验室的信息系统中，注意使用了哪种抗凝血剂，因为它可能会影响流动分析，并选择一种方法来溶解红细胞。²活死染料对于区分活细胞和死细胞很重要，因此将分析限制在活细胞上，并将死细胞排除在分析之外，死细胞可能会自发荧光并引起背景噪声。¹⁵如果仅对细胞表面受体染色，则可使用新鲜细胞，并可使用膜完整性染料来区分活细胞和死细胞。²如果也对细胞内蛋白进行染色，则表面受体的染色需要在细胞内染色的固定和渗透之前进行。此外，用可固定活性染料进行预处理对于活死人的鉴别是必要的，因为固定过程会渗透细胞，因此不能使用膜完整性染料。¹⁶

坚持是关键

流式细胞术是一种敏感的技术，为了在实验之间获得可重复的结果，重要的是限制变化，即使是在更微妙的实验参数之间，例如，细胞保持的温度，抗体染色程序和抗体偶联荧光团暴露于光下。

试剂验证

尽管试剂是按照严格的标准制备的，批次与批次之间的差异仍然可能发生。此外，储存条件和运输和处理程序可能会影响敏感试剂，如抗体。为确保试剂的性能符合预期，试剂验证可以通过以下方式进行:(i)与参考物质比较的直接分析，(ii)新旧试剂的平行测试，例如打开新试剂瓶/管时的重叠测试，以及(iii)与对照的比较，例如使用商业QC细胞样品。²新批次的抗体浓度可通过对细胞(如淋巴细胞)的抗体滴定来验证，以确定测定中使用的抗体浓度。此外，良好的记录保存，如登记有效期和批号，也有助于减少因储存和时间引起的试剂变化。

数据分析

流式细胞术收集的数据有多种分析方法，显示数据的格式也有多种。需要仔细考虑数据的完整性和特定分析方法的基本原理，以确保其满足临床测试的需要。一旦建立了数据分析方法，重要的是对同一类型的临床流量试验以相同的方式分析结果，例如前体b细胞淋巴母细胞白血病的免疫分型，以获得一致的结果。这包括:(i)门控程序，一个决定分析首先考虑哪个荧光通道的过程，²(ii)种群的正确标记(例如，哪些细胞是前体b细胞)，(iii)种群在总事件中所占的百分比，或在种群中所占的百分比，以及(iv)用于绘制结果的刻度类型，例如，对数与双指数(HyperLog或“Logicle”)。^{2、15、17、18岁}

感知模式

重要的是要善于识别健康样本中的细胞群分布模式，以便来自疾病患者的样本是可识别的和突出的。熟悉预期的单元分布模式还有助于了解自当天早些时候校准和标准化以来，仪器内部是否发生了问题，例如由碎片引起的流单元内的湍流，这可能会影响结果。

保护患者身份

由于患者的隐私，重要的是要确保样本和数据的机密性和安全性。密码保护和加密措施可以促进这一点。此外，防止数据丢失的数据完整性和备份也是必不可少的保障措施。更新的流式细胞仪可以在校准后存储QC报告，使QC历史可以直接访问，以观察随着时间的变化趋势。或者，Levey-Jennings图可以用来分析QC数据的演变。²质量控制值持续落在范围之外或持续高于或低于平均值可能表明仪器故障或漂移。

免责声明:我们不以任何方式指导临床流应该如何执行，而只是提供一个教育指南。

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