准备12招蛋白质非共价复合物进行质谱分析

准备、净化、分析和识别组成组件的非共价相互作用的蛋白复合物的质谱已成为明显简单易懂的书在过去二十年中,生物化学和分析化学的发展。尽管生化过程和质量spectrometry-based分析仪器非常标准和健壮在许多实验室,仍有许多点,很容易被忽视的成功这些复合物的制备和分析。本指南聚集超过10年的背景和经验在执行和优化蛋白质interactomics。重点是提高和解决所有这些看似琐碎,但非常重要的细节,可以帮助科学家生成样本分析,液相色谱质谱(LCMS)和蛋白质的识别复杂的组件。这些技巧是一个援助后参考文献1和2中描述的协议(1、2)。

彻底准备减少下游实验问题

开始前一个实验孤立和女士准备分析蛋白复合物,有一些一般考虑总是记住:

• 根据数量的方法进行了净化,认真考虑运行整个实验在4°C冷的房间里。如果这是太人道地不舒服,当然可能执行一个标准实验室的实验在板凳上。确保所有缓冲区等在4°C在冰上冷却。
• 考虑为日常使用和丢弃剩饭整除缓冲区。这可以防止交叉污染,缓冲成为老“陈旧”,并最终节省金钱的实验室。
• 在non-autoclaved玻璃器皿准备缓冲和解决方案。避免使用玻璃器皿,用洗涤剂洗净。检查列,珠子和机架的前一天实验。
• 准备和清晰的标签管为免疫印迹整除。
• 尽可能避免角蛋白污染通过确保无尘工作台,不要离开提示和缓冲区开放环境。
• 准备所有解决方案与极端的保健与角蛋白减少污染。
• 使用手套——改变角蛋白污染之嫌。总是使用过滤提示,以防止交叉污染的样本(热压处理过的技巧是污染的来源)。
• 保存并存储所有列材料或上层清液,洗等,保存所有珠子,并保存列。这可以在故障诊断和跟踪关键一个问题如果LCMS数据不确定许多蛋白质。

临界点的质谱分析

最大的问题之一,影响MS-generated数据样本污染的质量。这仍然可能是最被忽视的点现代质谱分析。污染的来源可以是化学或生物,例如,聚合物从洗涤剂所必需从细胞释放蛋白复合物,使用浸出的错误类型的塑料聚合物样品,和其他丰富的参加高水平的蛋白质。这些包括臭名昭著的角蛋白和自然产生的羧化酶co-purified亲和纯化过程的第一步中(1)。

避免角蛋白和其他蛋白质污染

永远不会忘记!角蛋白是一种蛋白质,存在于大量人类已经或居住的地方。在准备细胞溶解产物和affinity-purifying蛋白质复合物,非常重要的一点,经常会误解在质谱样品制备是清洁工作。在这种背景下,清洁是指没有污垢和灰尘,而不是指在无菌条件下工作。当然,手套是至关重要的,是保持样品制备和所有相关的区域尽可能干净无污垢,灰尘和碎片。强烈建议使用新鲜的耗材和不使用plasticware已经离开开放的环境和覆盖着一层厚厚的灰尘。它包含人类皮肤粒子(通常是羊蛋白质如果实验室同事穿羊毛套头衫),最终在实验中。简而言之,避免角蛋白污染实验步骤,持续使用无尘,不消毒/热压处理过的塑料管子,吸管技巧,等。此外,使用吸管技巧包含在样品制备一个过滤器。这消除了样品的交叉污染的可能性由于不正确的使用示例的吸管和愿望的桶吸管,因此污染了你的下一个样品的蛋白质之前。

洗涤剂和聚合物污染最小化

另一个基本是避免不必要的接触洗涤剂:不培养你的细胞溶解产物在任何塑料列/管等残留洗涤剂准备细胞溶解产物可以外套plasticware然后有效地去除酸用来洗提你的蛋白复合物的关联矩阵。试剂和耗材质量是非常重要的。避免不稳定plasticware:聚合物可以从塑料浸出到你的样品。任何塑料应该使用酸或低pH值、稳定。样品很容易观察到的主要聚合物污染质谱和影响蛋白质复合体的质量鉴定。理想情况下,净化后的蛋白质样品应尽可能自由的洗涤剂。

细胞培养步骤

当谈到包含标记的细胞,细胞培养实践noncovalently-interacting蛋白质复合物,遵守实验室的规则你在哪里工作,按照标准程序。协议的参考2(2),5×15厘米的菜肴或2×10⁸细胞(暂停)。,至少50毫克总蛋白质/复杂的净化,推荐。理想情况下,使用新方法进行了净化溶解产物,然而,如果不可行快速冻结洗细胞颗粒在液态氮和存储直到需要-80°C。

准备细胞溶解产物

当准备细胞溶解产物包含完整,非共价相互作用的蛋白质复合物减少蛋白质降解是至关重要的。否则,蛋白复合物从细胞affinity-purified不会真正反映出体内的情况。因此,当务之急是执行所有步骤在冰上pre-cooled试剂和材料。这将增加复杂的产量和减少退化的可能性的任何相关的蛋白质。此外,进一步确保非共价相互作用的蛋白质复合物的完整性,强烈建议执行从新鲜细胞溶解细胞净化。

净化的蛋白质复合物:第一步

按照协议第一步根据参考2(2)。重要的在这一点上是freshly-prepare生物素的解决方案,而不是使用存储整除。生物素敏感紫外线光降解,随着时间的推移将失去效率。慢慢蛋白质溶解产物应用于准备列和允许溶解产物由重力流进入树脂。没有培养时间是必要的。在收集整除的流通型免疫印迹和潜在的故障排除,洗然后洗提列绑定蛋白的3×300µL刚做好的2.5毫米生物素1.5毫升塑料管。保存整除(30µL)免疫印迹分析和生物素洗脱的保存和储存剩余的珠子和列。

净化的蛋白质复合物:第二步

第二步的亲和纯化后蛋白质复合体(1),删除所有上层清液(即。,任何未装订的材料与antihaemagglutinin孵化后用吸管(HA)琼脂糖)。一定要删除所有生物素化的羧化酶,这些蛋白质导致高背景污染由质谱样品进行了分析。当洗任何珠子,旨在防止再悬浮含有洗涤剂的缓冲,因为这将导致一些洗涤剂涂墙壁和洗脱与酸后,洗涤剂再次将占主导地位的质谱数据。应用洗缓冲区(没有洗涤剂)的墙柱的“顶级”(水平以前的缓冲)以循环的方式洗洗涤剂污染从墙上的列。让第一个整除缓冲洗排水申请前第二个洗。外洗的列提示删除任何残留洗涤剂清洗缓冲。这一步是非常重要的生产样品polymer-free进行分析的质谱分析。没有极端的治疗在这一点上,蛋白质样品将污染的洗涤剂。洗涤剂、增塑剂是食腐动物。因此,在质谱分析中,这些组件优先电离的肽样本。 Ultimately, weak signals or no peptide signals are observed. Another important tip is to not let the columns dry out. Elute the sample immediately after the last wash otherwise there is the potential that some of the protein complexes may remain irreversibly bound to the column material. Once again, avoid plastic consumables and elute directly into a glass vial. We have seen that even short-term storage in plastic results in plasticizer extraction from the consumables. With long-term storage this problem is exacerbated.

洗脱蛋白复合物

复杂的蛋白质纯化蛋白可以直接从列筛选了成一个高效液相色谱法(HPLC)玻璃小瓶(包含125µL 1 M triethylammonium碳酸氢盐(TEAB)缓冲区)与500µL 100毫米甲酸存储在一个玻璃小瓶(最终浓度TEAB缓冲约。200毫米)。如果酸不洗提列,它可能需要应用少量的启动压力液体的流动。它还可能需要清除所有剩余的洗出液。一旦蛋白质被筛选了,轻轻混合中和酸和删除200µL洗出液。这可以用于如运行silver-stained凝胶(100µL)和/或免疫印迹(2×50µL)。这些样品可以整除为1.5毫升塑料管道和冻干。重要的是,把这个洗出液的体积,即使它可能不是必需的。剩余的425µL可以吸附在液态氮冷冻或冰箱存储在-20°C。不使冻干样品! ! Protein loss can occur, and it may be difficult to fully re-solubilize the proteins for the digestion step. Save all beads and columns, potentially boiling the beads after acid elution in Laemmli buffer to determine if any bait remained on the column.

消化蛋白复合物

有大量的协议用于减少蛋白质二硫化物键,阻塞免费的半胱氨酸残基烷基化剂,和解决方案消化的蛋白质。基本上,所有的工作好,你用这些方法不能出错。最重要的是,记住,成功消化蛋白质,如胰蛋白酶,pH值应该在7.5和8.5之间。存储酸化蛋白会导致蛋白质降解通过酸水解(3)随着时间的推移,因此;添加酸的消化淬火反应和停止不推荐这种酶的作用。奖金使用这种方法是,如果你希望使用其他蛋白复合物的另一个实验中,例如,与稳定同位素标记试剂定量质谱;样品已经在适当的标签和pH值条件不需要重新调整。

净化和浓缩蛋白复合物

后的蛋白质复合物被消化成肽,下一步是浓缩和净化这些肽从任何残留的盐分和污染物的质量,也会影响质谱数据。以下是基于参考(4),但许多研究人员倾向于使用替代商业产品或完全省略这一步,直接注入消化到LCMS系统。然而,下面给出一些提示和技巧可以帮助研究人员选择白手起家的停和走提取(阶段)列。注意,如果在任何时候在协议中的液体阶段建议不流经完全与离心,然后轻轻地把液体通过手动一个注射器。

酸化样品,吸管30μL tryptically-digested蛋白质(相当于5% (v / v)的消化)(2)成一个插头的舞台提示解决方案(甲酸0.4%,2%三氟乙酸(组织))添加到每个阶段的小费。寻找泡沫指示释放二氧化碳和酸化的样本。当务之急是消化样品酸化,以确保有效的绑定使用C18材料。负载更大的缓冲消化到一个阶段,有必要添加额外的30% (v / v)三氟乙酸(组织),以确保完成酸化的样本,如50μL舞台提示解决方案+ 180μL消化样品+ 10μL 30% (v / v)组织了一个卷240μL,最后组织~ 1% (v / v)的浓度。当离心法舞台技巧,不过快离心机肽不会有效地绑定到使用C18材料和材料将会丢失。再次注意,如果液体完全不流动,通过手动注射器。尽管plasticware技巧用于创建阶段,快速洗涤、洗脱减少提取聚合物的机会。

洗提绑定肽与50μL舞台提示洗脱缓冲(0.4%的甲酸,90%的乙腈)明确高效液相色谱瓶玻璃v型插入,每亲和力和池三阶段提示提取物净化到相同的玻璃小瓶。这将给足够的样本技术复制注射+“备用”注入以防注射丢失是由于仪器问题之一。除去乙腈从舞台上提示筛选了样品在真空浓缩器(例如,30°C 15分钟),直到剩下最后~ 2μL体积。避免干燥完整性的损失肽通过吸附到玻璃表面增加了。最后,重建样品~ 8μL 5% (v / v)甲酸~ 10μL最后一卷。添加8的倍数μL 5% (v / v)甲酸取决于有多少将由LCMS重复分析。量依赖于高效液相色谱样品环,可以相应调整。

计算量注入消化蛋白质的复杂

标记亲和纯化的蛋白质复合体是不同的每一个蛋白质,因此,之前tryptically-digested蛋白质的质谱分析,不可能确定样本数量上面建议适用于所有蛋白质复合物。如果观察到质谱弱信号,研究员可以返回到原始存储消化样品和使用更大的体积。如果强信号符合分析柱重载由质谱分析发现,较低的体积消化蛋白质可以re-purified和分析或纯化样品稀释。随着时间的推移,一个技巧,可以缓解猜测始终有一个标准蛋白质,如绿色荧光蛋白(GFP)标记。分析绿色荧光蛋白的亲和纯化与感兴趣的蛋白质复合体免疫印迹对标签会给结果表明相对强势的标签出现在方法进行了净化。例如,考虑5% (v / v)的消化affinity-purified GFP。这个量持续达到最大信号通过质谱分析,但没有分析柱超载。如果在免疫印迹,感兴趣的蛋白质有大约一半GFP的强度试验;然后双感兴趣的蛋白质的消化量应该净化和注射(即。,v / v) 10%。近似和想法是提供给一个想法的实验和不同蛋白质之间如何正常化,同时最大化分析深度。 Such streamlining must be customized for each individual laboratory and workflow.

引用

1. t . Glatter et al .,摩尔。系统。医学杂志。5237 (2009)。
2. e . l . Rudashevskaya et al。Nat。Protoc。8,75 - 97 (2013)。
3. m . Planyavsky et al。肛交。物化学。473年11 - 13 (2015)。
4. j . Rappsilber et al。肛交。化学。75年,663 - 670 (2003)。

由: