自动化质量Spectrometry-Based定量作者利用串联质标签(TMT)与SimGlycan试剂

介绍

作者研究的新兴趋势之一是创新与准确的定量分析女士聚糖有关。最近,我们已经推出了aminoxyTMT试剂,使有效的碳水化合物,相对定量labeled-glycan电离效率提高和增加分析吞吐量。这些试剂可以用于定量分析的原生N-glycans直接或LC-coupled质。但是,与蛋白质组学,如果不加以解决的一个主要挑战是缺乏信息工具来自动化的定性和定量分析协议。这些协议包括识别/定量的聚糖使用MS / MS数据和微分分析生物样品。SimGlycan软件重新设计精简等协议的定量labeled-glycoforms源于复杂的混合物。

方法

胰蛋白酶的消化的几个标准糖蛋白单克隆抗体治疗和释放N-glycans PNGase F糖苷酶。反相后,石墨化碳萃取/脱盐步骤,聚糖被贴上oxyTMT试剂根据协议进行了优化。标签聚糖进行分析使用Velos Pro质谱仪(热科学)在正离子模式下获得trap-HCD MS / MS的碎片。数据受到SimGlycan识别样本聚糖的结构。识别,我们分配TMT 130.13离子记者离子的控制程序允许自定义设置修正因素,计算总和/一般/中位数的记者离子强度、数量的MS / MS谱确定多糖。不同类型的图表促进多糖微分分析样本。

初步结果/文摘

TMT记者离子峰集群是最强烈的一份光谱特性的双重带电前体含有钠和一个质子加合物。为了测试软件的性能,HCD光谱获得在五high-mannose聚糖。HCD碎片的high-mannose多糖前体即780年,861年,942年,1023年和1124年m / z产生丰富的TMT记者离子,以及Y / B / a类型离子。MS / MS数据受到SimGlycan结构识别。程序标识N-glycan与碳水化合物残留(GlcNAc)为前体2(人)5 m / z值780,N-glycan (GlcNAc) 2(人)6 861年N-glycan (GlcNAc) 2(人)7 942年N-glycan (GlcNAc) 2(人)8 1023和N-glycan (GlcNAc) 2(人)9 1124,这是一个正确的赋值为所有high-mannose聚糖样品中。多数离子与完整的TMT标签携带Na加合物,通常是两种糖苷对减少分裂的结果。该计划使离子峰强度的定量测量记者。为了取消其他附近的山峰到TMT记者离子的干扰,我们设置一个定制的校正因子。统计计算来衡量每个多糖的相对数量/表达水平存在于样本构成总和/一般/中等/记者离子强度的标准偏差,比率和平均/平均每个TMT离子强度和控制TMT 130.13离子,Log2相对表达这些比率,数量的MS / MS谱识别每个多糖。微分分析和数据可视化是通过不同的图表。 Heat map displays relative intensities of TMT reporter ions for each identified glycan. Cluster dot plot shows Log2 expression levels of a glycan at different TMT reporter ions. The performance of the software for several standard glycoproteins and monoclonal antibodies were also examined in these studies.