Reduced-Bias小型图书馆RNA制备Gel-Free或低投入的选项

下一代测序(门店)的小分子rna大大提高我们对基因调控的理解,作为小分子rna可以调整或调节基因的表达重要组织维护和疾病。上天带来的敏感性、特异性和最大化数据采集和最小化成本的能力通过使用多路复用策略,允许许多样本与小RNA同时测序分析。这种策略使得研究人员能够执行基因组——宽,高深度测序研究,就不可能使用其他技术。能够快速有效地衡量这些记录或资料研究和临床应用具有十分重要的意义。

然而,小RNA序列通常遭受三大缺点:1)严重的偏差,使得测序原始数据不反映microrna的丰度,2)需要凝胶净化最终库,和3)缺乏低投入的协议。

偏见是在结扎步骤中引入小核糖核酸库。小型图书馆RNA制备包括切断适配器直接到3’,5’末端的RNA分子在两个独立的步骤,和这些结扎措施已被证明在图书馆准备中引入严重的偏见。最近的研究表明,插入随机基地的适配器使用非随机性适配器相比,大大减少了偏见。

小RNA序列的另一个主要的缺点是需要净化最终库通过凝胶,凝胶通常是通过页面。这需要的是由于小adapter-dimer分子与insert-containing分子大小的差异后,图书馆的PCR一步准备。在典型的DNA或RNA图书馆准备,insert-containing分子至少100个基点比adapter-dimer分子,因此可以使用撒了磁珠。然而,由于insert-containing分子只有~ 20 bp大于adapter-dimer小RNA分子库,撒大小选择是不可行的,必须执行和凝胶型的选择。凝胶的大小选择的必要性大大限制吞吐量和自动化的潜力小RNA图书馆准备,只有数量有限的图书馆可以运行在一个凝胶是一个劳动密集型的过程,并不适合自动化。

缺乏低投入的协议对于小RNA-Seq adapter-dimer形成也相关。小RNA序列是独一无二的,额外的PCR循环导致微不足道的偏见;因此,理论上应该可以创建低投入小核糖核酸库通过使用大量的PCR循环。然而,adapter-dimers出现在库也将极大地放大,最终导致图书馆adapter-dimer产品极其丰富,因此很难隔离insert-containing产品,导致测序数据很少的读取是有用的。许多方法被开发出来以减少adapter-dimer形成小RNA图书馆准备,但不幸的是没有一个有效的减少adapter-dimer到了这样一种程度,形成gel-free或低投入小RNA图书馆准备是可能的。

为了应对相关的缺点小RNA序列,Bioo科学开发了一个小型图书馆RNA制备方法,采用随机适配器gel-free大大减少偏见和特性或低投入的协议,这可能是由于显著减少adapter-dimer形成。该方法是目前NEXTflex™小RNA-Seq工具包v3。