单细胞测序的发展及其应用

人口的细胞并不像研究人员曾经认为制服。单细胞基因组DNA测序提供了洞察不同种类的细胞,可以出现在一个样本。即使在细胞基因相同,单细胞测序的RNA或表观遗传修饰可以揭示重要细胞多样性。在这里,我们将介绍单细胞测序技术的最新发展及其应用在不同领域如肿瘤学和微生物学。

单细胞测序是如何工作的

单细胞测序技术的出现之前,大量使用了测序。然而,当细胞在组织测序散装,稀有细胞稀释和平均。单细胞测序生物研究是非常有用的,因为它使细胞很少,无法培养。此外,它有助于了解细胞异质性在复杂样品。

单细胞测序的过程包括几个主要步骤:组织离解成细胞悬液时需要的样本是一个组织。 ¹ 如果样品已经存在的细胞悬液,可以使用它。接下来,使用精密控制目标细胞被困为单个细胞,流式细胞仪分选或微流体技术。使用微量吸液管精密控制技术是最便宜也是最费力而半自动单细胞微流体方法封装在水滴正变得越来越受欢迎。单个孤立的细胞溶解了捕捉尽可能多的DNA或RNA分子。接下来,为单细胞测序(scRNA-seq) RNA, RNA转化为互补(c)之前,反转录DNA进行PCR扩增。DNA、cDNA图书馆然后通过下一代测序技术准备和测序的基因组和转录组测序,分别。最后,生物信息学方法被用来分析数据。

单细胞测序是一个快速增长的领域。尽管工作流定义良好的,更好的生物信息学工具不断被开发为细胞集群生成更可靠的数据。此外,单细胞测序也被应用于广泛的科学问题,从环境分析癌症疗法。

改进集成来自散装和单细胞测序的数据分析

每种类型的单细胞测序方法提供了独一无二的信息解读异质性在一个复杂的细胞群。例如,单细胞RNA,化验transposase-accessible染色质(ATAC)和染色体构象(高c)测序提供了关于基因表达分析的信息,分别可访问的染色质区域和染色质联系人。然而,即使有单细胞RNA和ATAC实验,我们对具体的监管网络的理解是不完整的,如果我们不能连接3 d活动监管元素之间的联系和基因启动子——在这一领域,大部分测序提供了更好的信息。

曾和他的同事们提出了一个新的方法DC3 (De-Convolution和耦合的集群)呼吁提高批量和单细胞数据的联合分析,能够deconvolve数据批量配置文件到sub-population-specific配置文件。 ² 作者应用他们DC3 scRNA-seq联合分析的方法,单细胞ATAC测序(scATAC-seq)和大部分染色质免疫沉淀反应(Hi-ChIP)在小鼠胚胎干细胞经过四天的视黄段分化。

DC3确定三个亚类。作者关注子总体中两个表达EpCAM和CD38表面标记和独特的不同于其他群体。接下来,他们进行了Hi-ChIP实验,从循环的主要分析组件图资料、双阳性(EpCAM + CD38 +)样本的皮尔森相关系数(PCC) 0.7633与子总体中两个细胞,这是明显高于子总体中细胞1和3。这演示了反褶积的有效性和DC3大部分循环的数据在一个复杂的生物样品使用单细胞测序数据更好的细胞类型进行分类。

DC3方法应用到基因本体富集分析,曾和他的同事们还发现,DC3包含大部分循环的细胞提供浓缩效果比单独使用scRNA-seq数据。具体来说,当测序深度(即在基因组核苷酸的次数正在读)低,DC3-inferred循环信息提供了一种改进的特征的亚群体的独自scRNA-seq数据。这使得DC3一个强大的方法,因为它可以用来提高解释从现有数据集的单细胞RNA和ATAC测序(特别是那些较低的测序深度)通过执行额外HiChIP实验是简单的,不太贵。

多路复用单细胞测序理解癌症的异质性

肿瘤内异质性存在于病人的样本可能占治疗效果的差异。扭结和他的同事们想要了解这些差异是否由于本地肿瘤微环境或固有细胞的可塑性。“特别是,我们想知道如何在患者样本的多样性可以复制在“传统”细胞系,”说 伊塔Tirosh 魏茨曼科学研究所的首席研究员。

利用多路复用单细胞测序,他们试图调查大量的细胞系细胞多样性从癌细胞行百科全书(CCLE)。 ³ scRNA-seq -序列的团队利用汇集细胞系在计算之前将它们分配给集群基于批量RNA /基因表达式和单核苷酸多态性。这个方法很好,和细胞系作业为98%的细胞是一致的。有趣的是,作者发现细胞株培养,共培养,并没有显着影响的表达模式,表明内在细胞可塑性可能是独立时期的文化。

确定离散的细胞群体,作者利用各种计算技术包括t-distributed随机邻居嵌入和density-based集群和定义了一个新的术语——“复发性异构程序(右投手)”– that clusters cells by functional enrichment of their signature genes.

右投手已经被证明有用的分类细胞系。例如,右投手与上皮间充质转变(EMT)一个黑素瘤细胞系的明显特点。右投手分类也有助于确定药物的敏感性。作者筛选~ 2200高生物活性分子与细胞上皮衰老程序(右投手之一)和senolytics表明这群细胞敏感药物临床药物反应和预测。

“通过我们的研究,我们发现,大部分被认为在患者样本的异质性确实可以模仿在传统的细胞系中,和我们确定最好的细胞系模型。我们也能够描述许多不同的细胞异质性,每个共享的项目在许多细胞系,因此代表某些癌症的一个共同特征。其中一些项目在生理上和临床意义重大,如EMT的转移和衰老程序,我们发现预测对治疗的反应,”Tirosh说。“在未来,我们希望使用识别模型系统对跟踪特定”项目“intra-tumor异质性,进一步测试他们的监管和药物反应。”

海洋微生物单细胞基因组测序(DNA)

“海洋微生物是必不可少的重要的地球化学循环、营养补充矿质和气候的形成;他们组成了地球上最大的微生物之一,已经被meta-omics广泛探索方法,”说 Ramunas Pachiadaki 毕格罗,高级研究科学家对海洋科学实验室。

然而,培养的微生物学方法不能捕获环境微生物的多样性。现有的参考基因组仅占0.4%的海洋基因组。缺乏参考基因组是一个限制因素更好地理解我们的微生物环境。

Pachiadaki和团队表明单细胞基因组学是一个强大的、微生物基因组的另类文化无关的方法表示。 ⁴ 他们生成和大规模测序的基因组和随机库单放大海洋浮游细菌和古菌inclduing prokaryoplankton,扮演了一个重要的角色,如地球化学循环和气候的形成,从28种不同样品。这些样本横跨热带和亚热带的海洋表面纬度从40^o年代到40^oN。

“我们的数据集不同于早些时候单细胞基因组项目在其庞大的规模和随机的,无偏见的细胞选择策略,使它适合定量数据挖掘是不可知论者研究的原始假设。”

从他们的样品,团队生成的数据集称为全球海洋参考基因组(GORG)热带和发现大多数平均核苷酸身份值< 80%,这表明一些prokaryoplankton是相关的。这是基于标准的94 - 96%的微生物物种的平均核苷酸身份价值观作为相关的注释。

GORG热带地区图书馆代表平均40%的全球prokaryoplankton多样性尽管包含样本从大西洋和太平洋。特别是,作者发现metagenome碎片从印度洋的大力支持,微生物可以分散纵向穿越海洋。

团队继续附近序列完整、完成16 s rRNA基因序列的样本产生令人惊讶的分类任务。大多数的流行prokaryoplankton血统有小基因组(一到两个大型碱基对(Mbp)), GC含量低(29 - 35%)和小细胞直径(0.2 - -0.5毫米),与先前的报道是一致的。然而,也有很多做的血统不符合这种模式,因为他们已经平均基因组大小(> 3 Mbp)、GC含量> 45%,细胞直径> 0.4毫米,建议专门的生态位和不同的适应性。

Pachiadaki和他的同事们还发现,没有证据表明固氮作用通路的prokaryoplankton进行了分析,包括Planctomycetes门的成员,与最近的一份报告。GORG-Tropics库还提供了线索生物合成途径包括物种包含多个酮化合物合酶系统,显示公用事业产品抗生素一样自然。 ⁵

“这里我们使用的方法使第一有条不紊,lineage-resolved调查所涉及的基因簇在能源、氮和次生代谢。这证实了早先发现的基因可能在有氧存在光合作用Ca。Luxescamonaceae和显示这个血统的Alphaproteobacteria远比此前认为的更加丰富。确定的丰度和多样性生物合成的集群建议稀释的次生代谢物的重要性环境独立生存的prokaryoplankton向生物勘探路线图生物技术的应用程序。我们也建议随机单细胞基因组学应该作为一个新的仪器的方法研究土壤、植物、哺乳动物和其他微生物为了填补我们对这些重要的微生物的主要知识空白的球员在多样的生态系统的功能和macroorganisms,以及气候变化和全球其他过程,”说 Pachiadaki。

“我们正在使用获得的GORG-Tropics数据库分析全球模式的基因交换在海洋微生物和病毒感染。我们还扩大了GORG项目进入黑暗的海洋-透光表面下的水柱构成整个海洋体积的90%,基本上仍是无人,”他总结说。

引用:

1。Haque,恩格尔J,摄影师SA Lonnberg t .实用指南单细胞RNA-sequencing生物医学研究和临床应用。基因组医学。2017;9 (1):75。doi:10.1186 / s13073 - 017 - 0467 - 4。

2。陈曾W X, Duren Z,王Y,江R,黄WH。DC3是反褶积的方法和耦合集群从散装和单细胞基因组数据。自然通讯。2019;10 (1):4613。doi:10.1038 / s41467 - 019 - 12547 - 1。

3所示。扭结GS, Greenwald AC, Tal R, et al . Pan-cancer单细胞RNA-seq识别细胞异质性的循环程序。自然遗传学。2020;52 (11):1208 - 1218。doi:10.1038 / s41588 - 020 - 00726 - 6。

4所示。Pachiadaki毫克,布朗布朗JM, J, et al .图表通过单细胞海洋微生物基因组的复杂性。细胞。2019,179 (7):1623 - 1635. - e11。doi:10.1016 / j.cell.2019.11.017。

5。Karpiński TM。海洋与抗菌和/或大环内酯类抗真菌活性。3月的药物。2019;17 (4):241。2019年。doi:10.3390 / md17040241。