介绍电穿孔-一种用于转染和活性细胞生成的工具

电穿孔，也称为电透化，是一种有效的，非病毒传递系统，允许遗传物质(DNA和RNA)，蛋白质，药物或其他分子进入细胞。它使用精确的脉冲电流在细胞膜上形成临时的小孔，然后分子可以通过。这个过程可以用于各种各样的细胞，包括哺乳动物，¹昆虫,²酵母,^3.植物⁴还有细菌细胞。⁵

一旦进入细胞，药物和其他分子就会对细胞起作用。遗传物质可以保持独立(作为质粒)或整合到宿主基因组，这取决于下游的实验步骤。而电穿孔法，首次描述于1972年⁶但直到1982年，⁷曾被用作在体外工具多年，1991年首创在活的有机体内电穿孔⁸用于传递遗传物质，现在正在研究用于传递基因和细胞疗法对于一系列的条件。从那时起，电穿孔技术也得到了发展在子宫内在老鼠身上⁹还有其他实验动物蛋中蛋鸡和蛇。¹⁰

电穿孔是如何工作的?电穿孔机和电穿孔试管

当一个细胞能够吸收游离的DNA或RNA时，它就被称为“有能力的”。一些细胞类型或微生物种类，如枯草芽孢杆菌，¹¹它们天生就有能力，只需通过改变营养浓度来诱导应激，它们就能被诱导吸收DNA。然而，许多细胞并没有天然的能力，或者只能在特定条件下摄取某些物质，如抗微生物药物耐药盒，这些条件在实验室中繁殖非常复杂。化学物质可用于诱导某些物种的能力，如大肠杆菌（大肠杆菌)，¹²但同样，这并不适用于所有细胞类型或微生物物种。相反，电穿孔的过程可以使非活性细胞具有活性并易于实验操作。

为在体外在电穿孔技术中，目标细胞的悬浮液与你想要引入细胞的分子混合在导电溶液中，并放置在试管中(图1)。电穿孔试管在样品室的两侧都有金属板，允许电流通过混合物。将试管置于电转换器具有相应电触点的腔室中，使试管形成电路。电穿孔机上的控件允许用户设置要传递的电脉冲的电压、波形和持续时间，这些应针对目标电池类型进行优化。然后电脉冲通过样品室。

图1: 装有比色皿的电转换仪的主要部件示意图。资料来源:理查德·惠勒，转载于GNU免费文档许可证。

电脉冲会扰乱细胞膜的磷脂双分子层，¹³导致气孔形成(图2)。这是不对称的，气孔首先在电池的阳极一侧形成。同时，穿过薄膜的电势增加。这促使带电分子，如DNA，吸附到膜上，首先在电池的阴极一侧，然后通过这些孔进入细胞¹⁴(图3)细胞壁存在于植物细胞和一些细菌中，是大分子进入细胞的主要障碍。因此，原生质体(细胞壁已被去除的细胞)通常用于电穿孔，^4，15虽然已经开发了细胞壁完整的电穿孔方法。¹⁶

图2: 显示电穿孔过程中细胞膜中断和孔形成的示意图。

电脉冲通过后，毛孔开始重新封闭。¹⁷率¹⁸发生这种情况的时间因细胞而异，但通常在毫秒到分钟的范围内。在这个阶段，细胞是脆弱的，必须小心对待，直到它们有机会分裂。

图3: 示意图显示了电穿孔过程中的步骤和相关电荷，导致外源物质进入细胞，在这种情况下是质粒。

电穿孔协议示例

在建立电穿孔方案时，重要的是选择参数¹⁹这使得渗透，同时最大限度地减少对细胞膜的干扰，以最大限度地提高细胞活力，实验的可重复性和效率。需要考虑的因素包括:

• 波形
• 脉冲时间
• 磁场强度

脉冲通常分为方波或指数衰减波．方波脉冲迅速上升到其设定的电压，保持电平，然后在脉冲末端迅速切断。另一方面，随着指数衰减波，电压迅速上升到目标值，然后允许随着时间下降。方波通常用于哺乳动物细胞，而指数衰减波更常用于细菌、酵母、昆虫和植物细胞以及某些类型的哺乳动物细胞。虽然在不同的细胞类型中，两种波形都可以进行转染，但在细菌、酵母和昆虫细胞中使用方波时，转化效率往往较低，而指数衰减波往往会降低许多哺乳动物细胞的活力。¹⁹

脉冲的持续时间(通常为微到毫秒)可以直接输入方波。然而，对于指数衰减波，这不是一个预先确定的值，而是由于波的性质而受到其他实验条件的影响。相反，脉冲长度是用“时间常数(TC)，是电脉冲衰减到其原始电压的三分之一所需的时间长度(图4)。效率通常在TC为5.0左右是最佳的- - - - - -5.1对于细胞大肠杆菌，数值为4.0- - - - - -5.0被认为相当正常。然而，离这个值越远，效率就越低。较低的时间常数可能是由DNA质量差、清洗不足或细胞样本密度过大等问题引起的。较高的时间常数可以表明孔已经打开太长时间，并可能导致更高的细胞死亡率。

图4:显示指数衰减波电压随时间常数(T)下降的图形，表示电压达到其初始值的三分之一。

如果脉冲长度增加，电压通常会降低反之亦然帮助防止不可修复的细胞损伤。

的磁场强度为通过电极间隙传递的电压，单位为kV/cm。试管有不同的间隙大小，所以在优化电压时考虑到这一点是很重要的。如果已知所需场强，则可以使用以下公式计算任何给定比色皿尺寸所需的电压:

影响电场强度的其他因素包括电池尺寸(较小的电池通常需要更高的电压，以给定的电极间隙)和温度(在较低的温度下通常需要更高的电压)。

细菌电穿孔通常在短而高的电压脉冲(几百到几千伏特的微到毫秒)下效果最好，相比之下，来自高等生物的电穿孔细胞或组织通常需要更温和的条件。^20.许多电穿孔器为已经优化过的特定细胞类型提供了一系列的预设程序。

虽然对于许多电池类型来说，一个脉冲就足够了，但有些电池类型需要两个或更多脉冲，通常由多电转换器以预设的间隔自动传递。

让我们考虑一个细菌电穿孔的例子。

1. 成长一个细胞的健康培养．对于细菌菌株，积极分裂的指数期中期培养是一个很好的经验法则。对于某些细胞，如产生大量透明质酸胶囊的菌株，可能需要在生长培养基中添加额外的酶来去除胶囊，以提高过程效率。
   
2. 电池需要无盐，否则电流将通过周围的解决方案时，电脉冲传递。因此,洗细胞去盐;冰镇的0.5 M蔗糖是个不错的选择。当将细胞制成颗粒以去除生长介质和清洗剂时，要温和地处理它们，并使用冷却的离心机将细胞损伤降至最低。洗完后，把它们放在冰上，然后在同样的蔗糖溶液中轻轻悬吊。
   
3. 在冷却洗涤物和细胞的同时，将试管和要引入的物质放在冰上保持低温尽可能
   
4. 用移液管抽吸洗过的细胞放进试管里并轻轻加入要引入的物质，轻轻移液混合。
   
5. 在将比色皿放入电转换器之前，请确保其彻底清洁干．即使外面有几滴水也会导致电路短路，破坏你的实验(并产生一声巨响!)
   
6. 交付电脉冲并检查时间常数是否在预期参数范围内。
   
7. 添加冰冷介质并让它们在培养箱中恢复到正常生长温度。尽量避免突然的电击，因为这会增加细胞死亡，降低实验效率。
   
8. 一旦它们变暖并再次活跃地分裂(这取决于培养的细胞类型或菌株)，细胞就可以正常培养．在这一点上，如果正在使用，可以引入选择性的促进细胞生长的药物，这些药物已经吸收了目标物质，而不是那些没有吸收的物质。

虽然对于许多细胞系来说，较低的实验温度可以提高细胞存活率和实验成功率，但对于一些细胞来说，情况并非如此。^21，22因此，优化任何协议以适合您的特定单元是很重要的。

虽然电穿孔传统上是在悬浮细胞上进行的，但现在也可以在贴壁细胞上进行电穿孔。²³这在工作时非常有用培养中的细胞可能需要避免胰蛋白酶化的地方。

电穿孔转化-用电穿孔器制造细菌活性细胞

操纵细菌细胞的基因组成可能是可取的，原因有很多。例如:

• 制造一种用于疫苗的细菌工程菌株
• 阐明基因功能
• 插入一个编码标签的质粒，以便追踪细胞
• 工程基因编码一个理想的产品，以便使用他们作为微型蛋白质工厂

然而，许多细菌基因工程协议的关键部分依赖于将修饰过的遗传物质输送到细菌细胞中。对于不具有天然能力的菌株，电穿孔使这成为可能。²⁴DNA通常以质粒的形式进入细胞。在细菌中，这个过程被称为转换．选择成功转化的细胞的方法也经常被纳入这些质粒中，例如抗生素抗性基因。一旦细胞被允许从电穿孔中恢复，它们就可以在选择性试剂的存在下进行培养，这样那些没有成功吸收目标DNA的细胞就会被杀死，而那些存活下来并复制的细胞就会被杀死。含有目标质粒的细胞称为转化子。取决于下游应用，质粒可以保持独立，或者随后可以采取步骤将质粒整合到细菌基因组中。

电穿孔转染-真核细胞电穿孔

在细菌中，将核酸导入细胞的过程被称为转化，在真核细胞中，这被称为转化转染²⁵和细菌一样，可以通过电穿孔来实现。同时也让科学家能够改造真核细胞本身²⁶或者引入其他分子，转染也可以作为改造病毒的一种手段²⁷以帮助了解它们的发病机制和生物学²⁸并为疫苗接种创造改良菌株。

作为细胞本身，细菌可以被电穿孔和直接工程，然而，基因工程的过程是不同的病毒。在这里，宿主细胞，如哺乳动物或昆虫细胞，被目标病毒感染，正是这些宿主细胞进行电穿孔，引入所需的遗传物质，然后在病毒复制期间被合并。

电穿孔的其他用途

在活的有机体内基因治疗

和许多基因操作技术一样，基因疗法²⁹需要一种方法来将额外的、修改过的或“固定的”遗传密码传递到目标细胞或使有问题的基因失活。有许多方法正在研究中，包括使用病毒基因转移、纳米颗粒和电穿孔来治疗遗传性视网膜营养不良等疾病。^30.

不可逆电穿孔

虽然我们这里讨论的电穿孔被认为是可逆电穿孔，形成的膜孔是短暂的，但不可逆电穿孔也被用于癌症治疗³¹作为实体瘤的消融技术。³²就像可逆电穿孔一样，电流被施加到细胞上，导致膜上出现气孔。然而，在这种情况下，其目的是破坏细胞内稳态，导致肿瘤细胞死亡。也有证据表明，细胞内肿瘤抗原的释放起着一种抑制肿瘤的作用原位“肿瘤疫苗”，也提供了一个有前途的免疫调节治疗方面。³³

在子宫内电穿孔

作为研究发育过程的工具，传递质粒DNA的能力，例如编码标记蛋白，³⁴对发育中的胎儿中的特定细胞的研究已经引起了广泛的关注，特别是来自神经科学界(参考文献2)。^35，362001年首次成功演出，⁹在子宫内电穿孔已经被用来回答有关树突生长和突触连通性的问题³⁴发育过程中的细胞命运和迁移。³⁷到目前为止，它还没有被用于向人类胎儿提供基因治疗。

电穿孔疫苗和药物输送

虽然电穿孔通常与遗传物质传递到细胞有关，但它也可以用于药物和疫苗³⁸交付。这为大的或疏水的物质提供了通道，否则无法有效地穿过皮肤。³⁹它已被用于皮肤和透皮给药^40，41治疗包括癌症在内的疾病。⁴²DNA疫苗⁴³对抗炭疽，瘟疫，⁴⁴人类乳头瘤病毒(HPV)⁴⁵SARS-CoV-2,⁴⁶此外，由于大多数哺乳动物细胞天生不具有能力，直接注射裸DNA的成功有限，因此也开发了利用这种传递模式的方法。

电穿孔的常见问题

• 电穿孔参数-获得正确的电穿孔条件⁴⁷在处理新的细胞系或菌株时，这可能很棘手，需要优化。如果条件过于苛刻，细胞可能会永久受损，降低细胞活力和转化/转染率。如果太温和，可能无法形成有效的毛孔，也会降低成功率。
  
• 缓冲条件-最好的缓冲⁴⁷对于您的电穿孔将根据您的目标细胞而变化，并应进行优化。
  
• 要引入细胞的细胞数量和质粒/成分-使用适当和平衡数量的细胞和引入细胞的外源物质是很重要的。过高的细胞密度会导致电弧，而过少的细胞会降低实验的成功率。与存在的细胞数量相比，引入细胞的质粒/成分过少也会降低潜在的可实现效率。同样，这也是需要优化的地方。
  
• 细胞质量-如果在实验中使用的细胞在开始时状态不佳，这将对实验成功产生负面影响。尽量确保它们是健康的，没有污染物，并积极分裂，以提高电穿孔后的恢复。传代数高的细胞可能工作效率较低，因此应尽可能避免使用。过度剧烈的移液也会损伤细胞。
  
• 插入核苷酸/成分的质量-质量差或受污染的核苷酸样本将降低转化/转染效率，并可能降低细胞存活。高盐水平和大质粒(超过10 kb)也可能降低实验效率，因此在计划实验时应考虑。
  
• 细胞护理-细胞在电穿孔后是脆弱的，在恢复过程中必须小心对待。不这样做将增加细胞死亡。
  
• 灭弧-将组件放在冰上是一种极好的方法，可以保持它们的凉爽，并在电穿孔过程中保存您的细胞。然而，在将试管放入实验室内之前未能完全干燥，可能会导致短路，导致实验失败并可能损坏设备。除了腔室中的水分，残留的盐，过高的细胞密度或气泡，例如过度剧烈的移液，也可能导致在比色皿腔室中发生电弧。确保盐被彻底去除，细胞密度得到优化——查看制造商的建议作为指导——在添加和混合组件时，要轻轻地添加和混合。这将有助于防止气泡的引入，减少对细胞的损害。

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