介绍转染,转染协议和应用程序

能够改变的基因构成活细胞生物学发生了革命性变化。科学进步,从治疗遗传疾病基因治疗皮肤细胞重新编程到神经元,一直由增加精通外国核酸(DNA和RNA)引入细胞利用一种称为转染技术。

1928年,格里菲思提出了“转变原则”有观察到细菌细胞可能需要外国遗传遗传物质。¹这导致遗传物质DNA的发现,²这一发现使科学取得了巨大进展。在1960年代,病毒了遗传物质转移到动物细胞以一种受控制的方式和结果表明,外国遗传物质可能是在动物细胞表达;这打开了基因治疗的可能性。³同时重组领域技术的进步——发现质粒⁴其次是增加质粒的应用程序在1970年代和限制性内切酶的发现^5,6——促进基因的操纵。大约在同一时间,化学和物理的方法引入遗传物质进入细胞,如电穿孔,⁷磷酸钙转染⁸和脂质体⁹转染也发达,从而提供大量的方法来提供修改后的感兴趣的基因进入细胞。

转染方法的发展,许多发现在基础和转化科学可能和技术已经大量应用于生物学。这包括了解目标基因的作用在健康和病变细胞,揭示分子途径,设计基因治疗方法,细胞重新编程和许多更多。因此,转染现在不可或缺的分子和细胞生物学实验室技术。在本文中,我们讨论转染的基本面和概述的一些常见的使用方法。样本的协议,它可以作为一个起点包含最后,我们考虑的一些关键的应用转染。

转染是一种常用的技术用来转移外国核酸进入真核细胞。¹⁰基因转染的目的是改变宿主细胞的内容,从而改变所需的这些细胞基因的表达。

这里是重要的区分转染和转换。虽然这个词使用转染真核宿主细胞时,转换这个词是用来表示核酸细菌细胞的转移。这种区别是至关重要的,因为在高等真核细胞转换是指的过程成为恶性细胞。¹¹

转染技术的主要目的是确保所需的外国核酸可以穿过细胞膜,大量的核酸免受退化,使其细胞内的表达。核酸进入宿主细胞的转移可以通过各种物理、化学和生物方法。在大多数情况下,核酸的细胞吸收是通过介导的内吞作用¹²的核酸与载体(图1)。这些核酸的一部分可以通过所谓的避免溶酶体降解endosomal逃脱细胞核和使他们的方法,他们可以影响基因表达的转录。虽然这不是一个详尽的清单的方法用来实现转染,我们在这里总结一些最常用的转染方法。

图1:广义的图解表示转染的机制。

物理方法包括电穿孔和基因枪

物理的转染方法应用电气、机械或热的力量¹³促进核酸进入宿主细胞。一些例子包括显微镜下注射,电穿孔,即peg转染(基因枪),sonoporation,magnetofection和激光optoporation。在显微镜下注射方法使用一个特殊的针将核酸直接注入到细胞,其他物理方法包括诱导瞬态和可逆的细胞膜的透化作用,同时将核酸附近的permeabilized膜。¹⁴应用在电穿孔,短暂而激烈的电脉冲来实现瞬态细胞膜的透化作用。同样,超声波实现瞬态细胞膜透化作用在sonoporation;和同样的效果是通过使用控制暴露在一束激光在激光optoporation。即peg方法推动裸DNA涂有重金属粒子进入细胞使用气体放电。Magnetofection利用磁性纳米颗粒指导核酸细胞膜,它们可以被内吞作用的过程。转染的物理方法有一个好处,那就是它们不构成风险免疫原性病毒方法和不受限制的核酸序列的长度,可以使用如病毒和一些化学方法。然而,这些方法需要专门的和昂贵的设备和试剂,他们经常提供较低的细胞死亡率高的转染效率。

化学方法包括脂质转染

大量的化学试剂开发协助DNA / RNA穿过细胞膜。¹⁵这些包括阳离子脂质,磷酸氢钙,阳离子聚合物和纳米粒子。使用阳离子脂质体脂类称为转染脂质转染,涉及到周围的带正电荷脂质聚集形成带负电荷的核酸分子可以很容易地融入生物脂细胞膜,进入宿主细胞。带正电的磷酸钙与带负电荷的核酸分子形成一个复杂的分子,生成沉淀,通过内吞作用进入宿主细胞。磷酸钙转染法不需要特殊的试剂和便宜。然而,这种方法限制了再现性与转染效率低,取决于细胞类型。阳离子聚合物,如树枝状分子,线性或支化聚(乙烯亚胺)(PEI),聚(赖氨酸)等是阳离子聚合物的例子。几种聚合物纳米粒子、固体脂质纳米粒(SLNP)和无机纳米粒子已被用于化学转染。¹²

病毒的方法

病毒载体的转染提供了最高的效率和可以使转染多种细胞类型。Virus-mediated生物转染称为转导。虽然转染这个词有时被使用当核酸交付到宿主细胞是通过使用病毒粒子,转导是正确的术语应该被用来指viral-mediated交付的过程。腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒转导的开发。¹⁶腺病毒是双链DNA病毒,可用于转换为短时间内细胞分裂和非区分。他们可以引起强烈的宿主免疫反应和腺病毒需要执行的实验生物安全二级实验室。腺相关病毒(AAV)单链DNA病毒,无法复制。他们在宿主细胞产生较弱的免疫反应。逆转录病毒的RNA病毒的特点是集成的RNA逆转录后进入宿主基因组。这导致长期感兴趣的基因的表达。慢病毒、gammaretroviruses spumaviruses和alphateroviruses是逆转录病毒的例子用于生物转染。¹²

什么是稳定转染和瞬时转染的区别?

转染可分为稳定或瞬态(图2)取决于遗传物质的保留期限的宿主细胞。¹⁷如果转染核酸整合到宿主DNA或保留在宿主细胞核染色体外的元素,从而永久地改变所需的基因的表达,这个过程称为稳定的转染。稳定转染促进遗传物质的组成型表达细胞系和代克隆细胞系是有用的,大规模的蛋白质生产应用程序在基因治疗和稳定表达。

图2: 图代表稳定、瞬时转染的区别。

瞬时转染,另一方面,不涉及公司的外国核酸进入宿主细胞基因组中,导致短期目标遗传物质的表达。核酸往往从细胞由于环境扰动或细胞分裂。瞬时转染常被用来理解表情的变化的临时效果所需的细胞过程。

在这里,我们描述一个广义脂质转染协议¹⁸附着二级细胞系和初级细胞培养与质粒DNA(图3)。使用的大量的质粒DNA和试剂适用于一个单一的6-well板,必须根据培养皿的大小比例。脂质转染是一个相对较低的成本、安全、简单、快速的方法使转染细胞。虽然这个协议可以是一个很好的起点,将标准化和参数优化基于DNA / RNA的属性以及宿主细胞类型。所有程序都在无菌条件下进行。

图3: 所涉及的步骤使用脂质体转染试剂粘附细胞的转染。

一)在转染前:

质粒:高效转染质粒DNA的质量是非常重要的。感兴趣的基因通常是克隆到一个合适的质粒DNA骨干从合适的启动子下游。一个纯粹的和集中的质粒DNA转染需要做准备。

电镀的细胞:宿主细胞使胰蛋白酶化、清点和镀上一个适当的培养皿在完全培养基转染前18 - 24 h。细胞数量需要调整,以便达到50 - 75%的confluency转染的时间。必须注意避免污染和保持最佳的健康细胞。

B)转染:

1. 质粒DNA是稀释100年µL商用,专业转染媒体或血清,不需抗生素的细胞培养基。质粒DNA的用量的大小将取决于培养皿的细胞已经镀和需要优化DNA准备和细胞系。通常使用1 - 8µg 6-well菜每口井的质粒DNA。
   
   
2. 商用脂质转染试剂的选择(2.5 -50µL)是100年稀释µL转染媒体或血清,不使用媒体。
   
   
3. 质粒和脂质转染试剂稀释混合好,在室温下培养30分钟。
   
   
4. 孵化后,800µL转染或血清,不需抗生素的媒体被添加到混合来弥补转染体积为1毫升。
   
   
5. 包含细胞中5%的板有限公司₂孵化器,完整的文化媒体,每个冲洗与500年µL转染媒体和转染轻轻混合准备前一步中添加细胞。6日到24日的细胞转染混合孵育h在37℃的5%股份₂孵化器。

C) Post-transfection:

转染组合被替换为3毫升的完全培养基。细胞孵化至少48小时37℃的5%股份₂孵化器。细胞的健康应定期监测。

我们曾描述了生物的转染方法使用的病毒核酸。转导一词常被用来描述virus-mediated交付核酸进入宿主细胞。1952年首次证明转导噬菌体细菌细胞。¹⁹自那时以来,病毒载体开发将遗传物质注入宿主细胞利用某些病毒转导细胞的自然倾向。表1总结了病毒性转染的区别和转导。

表1:比较转染和转导。

转染	转导
外国核酸交付使用病毒性方法	外国核酸交付使用病毒载体
基因转移效率取决于细胞的类型,媒体等条件和相对较低	基因转移效率更高
血清在媒体干扰细胞的核酸	转导可以执行在血清的存在
这些方法相对无害的实验室人员	病毒污染需要小心处理。应实行适当的生物安全措施
通常需要专门的设备和/或特殊的试剂	相对容易执行
一些方法和试剂可以在细胞毒性	病毒感染的细胞可能会引起细胞病变效应,如插入突变和免疫原性
物理方法,如电穿孔,基因枪和显微镜下注射,和化学方法,如脂质转染和磷酸钙转染转染的例子	病毒转导由DNA病毒,如腺病毒、腺相关病毒RNA病毒,如慢病毒

转染方法有广泛的应用。在这里,简述了其中的一些。

基因疗法:治疗遗传疾病基因治疗是指通过沉默有缺陷的基因,替换有缺陷的基因修正版或放大一个基因的表达。多年来,基因疗法已经用于治疗镰状细胞性贫血等疾病,β地中海贫血,Duchenne肌肉萎缩症、血友病。^20.

DNA疫苗:DNA疫苗是疫苗与工程DNA质粒转染宿主细胞,促进重组抗原的表达体内。²¹这些抗原被主人的身体和刺激的生成适应性免疫。DNA质粒进入宿主细胞是通过在活的有机体内电穿孔。

基因沉默:转染细胞的RNA干扰(RNAi)等小分子干扰RNA (siRNA),瓦解mRNA,或微核糖核酸(microrna),抑制感兴趣的基因的翻译,导致基因击倒。基因沉默也可以通过使用CRISPR / Cas9系统。

稳定细胞系生成:稳定转染用于生成稳定的细胞系表达重组蛋白结构上。这些稳定的细胞系是非常有用的对于大规模生产重组蛋白。稳定细胞系表达重组蛋白或基因敲/常用于研究细胞过程了解蛋白质的结构²²在实验室。

病毒生产:病毒载体基因治疗等应用程序涉及到所需的基因插入病毒质粒骨架。质粒编码的不同组件病毒载体转染成第二个细胞系的组装和大规模生产的病毒。此外,病毒生产采用等代的重组病毒,甲型流感病毒,研究小说变异和病毒株的影响能力的病毒感染和疫苗的效率。²³

大规模蛋白质生产:重组蛋白单克隆抗体疗法和几个有许多应用,激素、酶、凝血因子重组蛋白质工业规模生产。²⁴此外,快速发展的领域精密细胞农业,这是一个可持续的替代传统农业,雇佣了转染作为一个重要的步骤,使实验室生产未来的食物,如牛奶、鸡蛋和植物血红蛋白。²⁵大规模生产重组蛋白的通过转染DNA重组到哺乳动物细胞,细菌、酵母、植物和昆虫细胞。

干细胞重新编程和分化:体细胞可以重新编程为诱导多能干细胞(万能),可以被诱导分化成特定的细胞类型特定的转录因子的表达。iPSC技术的发展有可能由于能力使转染所需的基因重组和分化的干细胞。这种技术已经导致人类疾病的细胞模型的发展和潜力巨大的治疗。^26,27

引用:

1。格里菲斯f .肺炎球菌类型的重要性。J Hyg (Lond)。1928年,27 (2):113 - 159。doi:10.1017 / s0022172400031879

2。艾弗里OT,麦克劳德厘米,麦卡蒂m .研究肺炎球菌的化学物质诱导的性质转换类型 :感应转换的脱氧核糖核酸分数从III型肺炎球菌分离。J Exp地中海。1944,79 (2):137 - 158。doi:10.1084 / jem.79.2.137

3所示。罗杰斯年代,Pfuderer p使用病毒作为载体的遗传信息。自然。1968,219 (5155):749 - 751。doi:10.1038 / 219749 a0

4所示。莱德博格j .细胞遗传学和遗传共生。杂志牧师。1952年,32 (4):403 - 430。doi:10.1152 / physrev.1952.32.4.403

5。丹娜K,内森·d·特定乳沟的猴病毒40 DNA的限制性内切核酸酶嗜血杆菌流感嗜血杆菌。《美国国家科学院刊年代。1971,68 (12):2913 - 2917。doi:10.1073 / pnas.68.12.2913

6。史密斯HO Wilcox千瓦的限制性内切酶嗜血杆菌流感嗜血杆菌。即净化和一般属性。J杂志。51 1970;(2):379 - 391。doi:10.1016 / 0022 - 2836 (70)90149 - x

7所示。诺伊曼E, Schaefer-Ridder M,王Y, Hofschneider博士基因转移到老鼠lyoma细胞电穿孔在高电场。EMBO J。1982;1 (7):841 - 845。doi:10.1002 / j.1460-2075.1982.tb01257.x

8。格雷厄姆•FL van der Eb AJ。测定的一项新技术传染性人类腺病毒5的DNA。病毒学。52 1973;(2):456 - 467。doi:10.1016 / 0042 - 6822 (73)90341 - 3

9。Felgner PL Gadek TR,福尔摩斯M, et al。脂质转染:高效,lipid-mediated DNA-transfection过程。《美国国家科学院刊年代。1987;84 (21):7413 - 7417。doi:10.1073 / pnas.84.21.7413

10。Chong ZX易普SK,王寅。转染类型、方法和策略:一个技术审查。PeerJ。2021;9:e11165。doi:10.7717 / peerj.11165

11。Seeber f“转染”与“转换”:定义术语。Parasitol今天。2000;16 (9):404。doi:10.1016 / s0169 - 4758 (00) 01736 - 1

12。Fus-Kujawa,保诚P, Bajdak-Rusinek K, et al。概述真核细胞转染的方法和工具在体外。前生物科技Bioeng》。2021;9。doi:10.3389 / fbioe.2021.701031

13。他QQ, Fajrial AK Wirusanti倪,Slansky我,丁x回顾新兴物理CRISPR / Cas9-mediated基因转染方法编辑。开展。2020;10 (12):5532 - 5549。doi:10.7150 / thno.43465

14。Villemejane J,米尔LM。核酸转移的物理方法:一般概念和应用程序。Br J杂志。2009,157 (2):207 - 219。doi:10.1111 / j.1476-5381.2009.00032.x

15。Midoux P C Pichon Yaouanc j j, Jaffres便士。化学基因传递向量:当前综述聚合物,肽和脂质含有组氨酸或咪唑作为核酸载体。Br J杂志。2009,157 (2):166 - 178。doi:10.1111 / j.1476-5381.2009.00288.x

16。Bouard D, Alazard-Dany D,宠儿F-L。病毒载体:从病毒学到转基因表达。Br J杂志。2009,157 (2):153 - 165。doi:10.1038 / bjp.2008.349

17所示。Kim TK Eberwine JH。哺乳动物细胞转染:现在和未来。肛门Bioanal化学。2010,397 (8):3173 - 3178。doi:10.1007 / s00216 - 010 - 3821 - 6

18岁。Hawley-Nelson P, V市政债券同样,摩尔毫升。使用阳离子脂质转染真核细胞培养的试剂。咕咕叫Protoc杂志。2008年,81 (1):9.4.1-9.4.17。doi:10.1002/0471142727. mb0904s81

19所示。津德尔ND,莱德博格j .沙门氏菌基因交换。J Bacteriol。1952,64 (5):679 - 699。doi:10.1128 / jb.64.5.679 - 699.1952

20.Bulaklak K, Gersbach CA。曾经和未来的基因治疗。Nat Commun。2020;11 (1):5820。doi:10.1038 / s41467 - 020 - 19505 - 2

21。Flingai年代,Czerwonko M,古德曼J, Kudchodkar年代,Muthumani K,维纳d合成DNA疫苗:改善电穿孔和co-delivered基因佐剂疫苗的效力。前面Immunol。2013;4:354。doi:10.3389 / fimmu.2013.00354

22。Bussow k稳定结构生物学的哺乳动物细胞系生产商。当今结构生物学观点》。2015;32:81 - 90。doi:10.1016 / j.sbi.2015.03.002

23。霍夫曼E,诺伊曼G, Kawaoka Y, Hobom G,韦伯斯特RG。DNA转染系统从八代的甲型流感病毒质粒。《美国国家科学院刊年代。2000,97 (11):6108 - 6113。doi:10.1073 / pnas.100133697

24。Shrivastava Tripathi NK,最近的事态发展在重组蛋白的生物工艺:表达式主机和过程开发。前生物科技Bioeng》。2019;7:420。doi:10.3389 / fbioe.2019.00420

25。Dupuis JH,张LKY,纽曼L,迪博士,雅达。精密细胞农业:未来的角色重组表达蛋白食品。压缩机转速食物Sci Saf。2023;22 (2):882 - 912。doi:10.1111 / 1541 - 4337.13094

26岁。莫顿J, Marchetto MC, Bardy C,计跳频。评价细胞重新编程,分化和转换技术在神经科学。Nat转速>。2016;17 (7):424 - 437。doi:10.1038 / nrn.2016.46

27。马德里M, Sumen C Aivio年代,Saklayen n自体诱导多功能干细胞细胞疗法:承诺,进步,和挑战。咕咕叫Protoc。2021年,1 (3):e88。doi:10.1002 / cpz1.88