细胞培养质量控制:再现性的关键

细胞培养是不可或缺的在体外在生物科学研究。它涉及细胞永生化细胞系或主要生长在人工环境中样品。细胞可以作为模型分析等一系列不同的科学研究药物或其他化合物对经济增长的影响,生存能力和新陈代谢,或作为模型不同的疾病。他们之前初步研究中经常使用在活的有机体内实验进行。

的实用性和适用性的结论来自于细胞培养实验很大程度上依赖于质量控制(QC)进行。适当的质量控制可以确保细胞系模型提供可重复的结果,让自信地得出结论。忽略QC实验室在细胞培养可以研究成本和巨大的时间和金钱,和数据从实验室无法证明适当的质量控制不太可能发表。

博士Nikoleta Daskoulidou,英国卡迪夫痴呆研究所,副研究员工作理解先天免疫在阿尔茨海默病的作用。作为工作的一部分,Daskoulidou博士使用干细胞技术作为细胞模型。她描述了她的研究质量控制的重要性:“我相信,可怜的质量控制的主要原因是缺乏再现性和潜在无效的研究数据。对我来说是非常重要的测试单位,我用纯洁和表型的细胞。”Daskoulidou博士提到的她在研究利用QC方法,包括“检查特定的表达式(表达式)水平标记和检测潜在的预断的缺失。“这是对她的研究特别重要,看着阿尔茨海默病的编码序列变异。

本文将概述QC在细胞培养的四个主要方面,并描述它们是什么,以及为什么我们应该实施。

流式细胞术协议

今天的工具提供了一个数量的增加可检测的荧光参数所有测量在同一时间在同一细胞。下载这个手册信息协议包括样品制备、免疫细胞刺激和表型分析。

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你的细胞系是你认为他们是什么吗?

这可能听起来像一个明显的问题,但不幸的是,研究人员,这不是我们可以认为是理所当然的。由于诸多原因,可能与细胞1)从不同的器官;例如,肺和胃肠道,2)从不同的癌症类型,3)从不同的有机体,如鼠标上皮和人类上皮细胞。此外,近年来,CRISPR革命意味着大量的编辑细胞系存在并关闭必须小心,以确保父母行保持独立。 ¹ 实验运行错误的细胞系的影响是巨大的。在体外工作是一个有缺陷但是非常有用的模型预测系统的影响在活的有机体内。例如,如果在药物筛选,使用mis-identified细胞系,为进一步实验结果的适用性是妥协。这会浪费资源,也是潜在的危险如果不合适的化合物在活的有机体内研究。根据克拉拉博士为查理尔大学的博士后研究员里约热内卢STR打字是“非常重要的结果重现性和基本方法验证和药物发现。博士为查理尔,世卫组织目前正在调查DNA损伤反应的影响,关于神经发育和神经退行性变的基因组不稳定性,指出,STR打字虽然非常重要的往往是“做经常低于它应该“她在实验室和实验室,确保完成收到的细胞系,并定期在一些段落。”

污染有不同的细胞系据报道,发生在大约20%的速度在所有文化。²细胞识别的问题加剧了当细胞系具有相似的表型,如形态学和增长率。主要的方法来确定确切的细胞培养或收到STR打字。STR打字利用小人类DNA生物包括不同个体之间的差异。STR;短串联重复序列,发生在基因组和非编码DNA的一部分,包含concatemeric重复。DNA复制错误在这个领域导致女儿DNA链与增加或减少数量的重复发生。在人口层面,这导致许多不同数量的concatemeric重复一个STR位点。

STR输入了重复的数量在不同的STR基因座。商业STR包检查16-23位点相比,然后参考数据库确定细胞系的身份被测试。²匹配的可能性极低,大约1 x 10¹⁸个人。²

最近的进步STR打字涉及包含更多的位点,27日整个基因组,改善基因组区域的直接放大以及加快PCR循环功能,可以减少处理时间。尽管如此,对于细胞系验证,分析放大了amelogenin基因和17个位点。STR打字的黄金标准对于这个应用程序是由几个不同的公司,工作ISO 9001和ISO / IEC 17025质量标准。

细胞培养:机遇和挑战

细胞培养的需求急剧增加,细胞培养方法越来越多的被用于研究。学习更多关于下载该电子书产品正在开发的细胞培养实验室,h噢细胞培养领域将会改变在未来几个月和h噢我们可以满足今天的细胞培养的挑战。

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污染预防和筛查

除了确保你的细胞类型是你认为它是什么,保持细胞培养自由污染是质量控制的另一个方面。这是必须确保可再生的和可靠的结果。最频繁发生的细胞培养污染来自细菌,真菌和支原体。Daskoulidou博士的做法在她的实验室包括“检查潜在的细胞株每隔几周中支原体污染。“这对支原体是特别重要的,因为它不能被眼睛看到的显微镜,所以可以长时间未被发现。 ³

利用措施,防止污染以及筛选将减少负面影响的实验。预防的方法包括使用良好的细胞培养实践,包括在层流罩、消毒试剂,plasticware和玻璃器皿,⁴所有这些将减少污染的风险。

筛查包括细胞生长媒体的视觉检查颜色,常规显微镜检查支原体的细胞在文化和不能用显微镜看到的,应该进行细胞培养的常规测试。⁵最常见的支原体检测方法包括微生物文化,DNA与荧光染料染色和PCR检测支原体核糖体rna分子。^6,7

识别和纠正指南与附着细胞常见的细胞生长问题

虽然非常受欢迎的在生命科学研究者,细胞培养可以是一个非常困难的工具与在实验室工作。与其他常见的实验室工具,如电泳、色谱法、细胞培养使动态,持续使用生物体。下载本指南关于t发现解决问题的建议热处理工艺,我ncubators和culture媒体。

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你处理你的细胞培养正常吗?

一旦我们确信我们的细胞正是我们认为他们是谁,他们是免费的从微生物污染,质量控制的另一个方面是我们维持细胞在实验室当他们越来越。

细胞种植传统的一次性塑料水瓶;一定数量的细胞放入烧瓶和生长介质。

根据细胞系的生长速率,在3 - 5天后,细胞需要通道;一些和新鲜的生长培养基添加删除。当这个已经重复很多次(精确的数量取决于细胞类型),但一般15-30x,细胞应该丢弃,另一个批处理解冻。⁸Daskoulidou博士评论说,在处理特定的细胞类型,如干细胞,诱导多能干细胞在她的研究中,“我确保我使用低通道细胞。”

利用这些QC方法增加了细胞的可能性将持续应对不同的条件和实验。经常会导致未能通过细胞融合,对于一个给定的区域,有太多的细胞瓶或生长介质。这可以影响增长率和新陈代谢,这意味着当实验,细胞可能会有不同的反应。使用细胞和一个非常高的通道数量可能意味着电池耗尽时,接受衰老,已经开始变得更加分化或特定人群和主导文化。⁹

除了这些质量控制实践,有一些检查,可以进行细胞如:表达的蛋白质,增长率,生存能力,形态。如果这些改变,细胞应该丢弃,和较低的通道瓶解冻。⁹

从哺乳动物细胞培养到纯蛋白质:减少你的细胞收获时间

对于治疗的应用程序来说,它是重要的蛋白质生产从哺乳动物细胞系是有效和纯洁。下载这个应用注意发现瞬时表达系统使快速生产蛋白质,w管弦乐队在毫克量和obtains重组蛋白。

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你存储和分享你的细胞培养适当吗?

除了维持细胞同时增长,质量控制细胞系存储和传输是至关重要的。这可以分解成三个关键部分,要求质量控制:1)冻融过程,2)存储,3)文档。

不培养细胞时,存储的标准方法是在cryovials储存在液氮的汽相。

1)正确的冷冻剂(胎牛血清(的边后卫)与5 - 10%二甲亚砜(DMSO溶液应该使用)和冷冻应该慢慢地发生。这能保护细胞免遭晶体的形成。与之相反,迅速解冻必须发生在水浴和细胞迅速转移到介质没有从DMSO DMSO溶液,以避免损坏。¹⁰

2)质量控制的存储包括液氮气瓶与普通充气的正确保养和检查油箱密封,确保恒定的温度和安全目的。¹¹是一种很好的做法几瓶存储在不同的位置,以确保整个股市不会丢失如果一罐被攻陷。转移细胞株在公司或研究机构也可能发生,特别是在合作。适当的包装和转移方法,确保细胞生存能力不是妥协是关键。

3)存储和传输,以及使用标准化的协议,标识和文档是必要的质量控制。如果没有这些措施,可以得到细胞并不是我们认为他们是什么,浪费时间和金钱如上所述。博士为查理尔指出的重要性在知道你的身份冻结和评论,”STR打字还建议如果你正在计划一个冷冻细胞库。“适当的标签包括标记的细胞结合个人cryovials:彩色盖子,贴纸或cryo-safe标记笔表示细胞系,收据日期、数量和通过任何改变或基因编辑进行了。最近的进步跟踪存储细胞系和样本包括软件解决方案,使跟踪和记录样品的细节在一个虚拟的冰箱。

你使用标准化的试剂吗?

细胞系可以影响他们的培养方式和存储如上所述,也由所使用的试剂。最重要的试剂细胞培养基和血清用于培养细胞。

不同的细胞系或细胞类型需要细胞培养媒体不同的组件,但是它们通常包括葡萄糖、盐、维生素、氨基酸和其他营养物质。此外,一些类型的血清是必需的,一般的边后卫。¹²

组件的差异这些试剂可以改变增长率,生存能力和其他细胞系的特点,因此质量控制是必要的。细胞培养基本身是直接标准化;有许多不同的公司生产和销售媒体和开展他们自己的测试和灭菌。也有可能为实验室和研究所介质内部做准备。细胞培养基的制造商和供应商,将进行一系列的标准化考试在每批生产包括筛查常见的污染物。供应商将提供一个证书的分析说明媒体污染物是免费的,根据一组配方与生产制造协议。

的边后卫不是制造,它是收获。因此受到更多的批次之间的差异和为此需要更多的测试来确保再现性和质量控制。¹³测试的一个关键部分的边后卫是确定是否有任何不同的细胞生长时的行为不同的批次。因为这个原因,使用一批整整一组实验是可取的。

不同媒体的终端用户测试批次识别任何变化在细胞表型是重要,因为不同的细胞类型有不同的敏感性最小变化公式。这个地区最近的进展包括更深入检查细胞行为的培养条件,包括基因筛查,检测细胞的蛋白质组和代谢组变化的识别。¹⁴

质量控制一直是和仍然是良好的细胞培养实践的支撑。它最小化之间的变化实验,提高了结果的鲁棒性。此外,随着频率增加,出版期刊要求的证明QC在研究为了发表论文从给定的实验室。细胞系身份验证和识别、筛查污染,适当的细胞培养实践、存储和利用标准化的试剂都应该定期进行质量控制的重要方面。许多技术进行质量控制已经历史悠久,然而如上探索,有许多新的发展包括快速的实验室测试套件STR打字³和支原体检查、软件跟踪存储细胞系¹⁵且样品和访问组学筛查工具,以便进一步评估细胞随着时间的推移或应对新试剂。¹⁶这些新技术可以使细胞更精确的质量检查或增加易用性将QC纳入常规实验室实践。

引用

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2。Capes-Davis, Theodosopoulos G,特金,et al。检查你的文化!交叉污染或被认错细胞系的列表。Int J癌症。2010年,127 (1):1 - 8。doi:10.1002 / ijc.25242

3所示。里德Y, Storts D,里斯期T,小l .认证STR人类细胞系的DNA分析分析。:Markossian年代,格罗斯曼,Brimacombe K, et al .,。实验指导手册。礼来公司和国家医学转化中心;2004年。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144066/。2022年4月11日通过。

4所示。Cote RJ。灭菌和过滤。Protoc细胞生物学观点》。2001;第一章:1.4单位。doi:10.1002/0471143030. cb0104s01

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