低温电子显微镜:用复杂的见解指导下一代疗法

2020年，世界各地的研究人员聚集在一起，寻找冠状病毒大流行的解决方案，展示了科学界令人难以置信的合作精神。现在，这项研究仍在继续，我们正在努力抗击冠状病毒变体，并为下一次大流行做准备。这些科学家中有一位斯蒂芬·布朗恩助理教授他使用冷冻电子显微镜(cryo-EM)研究了SARS-CoV-2 3a蛋白。通过他实验室的密集工作，以及与世界各地科学家的合作，布朗恩和他的团队能否确定3a离子通道的结构达到2.1 Å分辨率-考虑到这种膜蛋白的难度和小尺寸，这是一项了不起的壮举。

生理学与结构生物学

在越来越小的尺度上观察生理系统推动了医学的发展。显微镜使我们能够直接观察细胞和病原体，同时监测各种治疗对它们的影响在体外而且在活的有机体内．一旦我们达到光学显微镜的极限，我们就开始利用电子显微镜在更小的尺度上观察细胞，不仅清楚地看到它们的表面，而且还能看到它们内部的细胞器和结构。通过这些观察，我们开始更好地理解细胞与病原体的相互作用，以及我们如何破坏它们来保护自己。晶体学将我们推进到对单个蛋白质的结构分析。这些基本的见解使我们了解蛋白质的结构如何与它们在体内的功能相关联，以及这些结构的破坏如何导致生理功能障碍。

结晶学是一种高度成熟的技术，可以用来确定复杂蛋白质的结构，甚至是一些小的蛋白质复合物，但该技术存在固有的局限性。从名字就可以明显看出，晶体学依赖于样品蛋白质的相当大的晶体来产生衍射图案。随着样品的增大和疏水性的增加，结晶变得越来越具有挑战性。这意味着像膜蛋白这样的系统对晶体学来说特别具有挑战性，因为它们有很大的疏水区域，被设计成嵌入脂质膜中。人们开发了各种人工结构来模拟膜环境并稳定蛋白质，如洗涤剂胶束和脂质立方相介质，但这些只会使结晶更加具有挑战性。

从根本上说，这给我们的观测能力留下了一个缺口。我们可以看到细胞，我们可以看到很多单个的蛋白质，但我们还不能在这些尺度之间架起桥梁。我们无法看到蛋白质在复合物中的作用，或者在活的有机体内．如果我们能够实际观察到从细胞到原子结构的完整生理尺度，我们就可以对疾病和失调产生高效和有针对性的治疗方法。现在，冷冻电镜技术的进步有望弥合细胞生物学和分子生物学之间的鸿沟。

结构生物学中的冷冻电子显微镜

Cryo-EM描述了一组技术，包括单粒子分析和冷冻断层扫描，这些技术是在低温下在专门的透射电子显微镜(cryo- tem)上进行的。单粒子分析是迄今为止最流行的低温电子显微镜技术，以至于术语“低温电子显微镜”经常被用作单粒子分析的同义词。

在低温电子显微镜中，水样品首先被快速冷冻或玻璃化，将蛋白质固定在一层薄冰中。如果没有晶体冰的破坏性形成，悬浮的蛋白质基本上被锁定在它们的原生状态。然后将样本转移到低温透射电镜，在那里对数百个单独的蛋白质分子进行成像。由于样本在溶液中是随机定向的，图像提供了蛋白质从不同角度的2D快照或投影。然后，这些图像通过计算重新组合成样本的3D表示;值得注意的是，样本的对称性越高，重建就越容易。随着现代电子探测器、稳定的能量过滤器和更好的电子源的出现，冷冻- em结构的分辨率可以可靠地达到< 3 Å，并且甚至有人报道了原子分辨率的结构 对于标准蛋白质样本．

由于低温电镜成像单个蛋白质，因此不需要结晶，这使得该技术非常适合于历史上对结晶学具有挑战性的样品。这包括膜蛋白和大的配合物，两者都很难形成足够的界面来符合晶格。Cryo-EM也非常适合用于膜蛋白稳定的方法，比如脂质纳米片和清洁剂胶束。

SARS-CoV-2 3a蛋白的冷冻电镜研究

随着世界连续第二年继续与COVID-19作斗争，越来越明显的是，与冠状病毒相关的疾病是我们未来不可避免的固定现象。发现和新型冠状病毒刺突蛋白分析展示了结构生物学的巨大力量以及它在高效疫苗开发中的关键作用。现在，研究人员正在竞相扩大我们对冠状病毒的了解，以跟上新疾病变体的出现。这不仅包括变异刺突蛋白的快速结构分析，而且还包括其他冠状病毒蛋白的研究这可能成为额外的治疗和/或疫苗靶点。

MSP1E3D1纳米片中3a二聚体在2.1-Å标称分辨率下的冷冻电镜图。来源:加州大学伯克利分校的大卫·克恩。

这些潜在靶点之一是由冠状病毒基因组的开放阅读框3a (ORF3a)区域编码的大3a蛋白。3a是一种假定的离子通道，存在于受感染细胞中可能与细胞死亡有关还有患者出现急性呼吸道症状．3a作为一种膜蛋白，由于其疏水性，固有的难以分离和结晶，使其成为冷冻电镜研究的理想目标。研究人员来自Brohawn而且包蒂斯塔加州大学伯克利分校的研究小组接受了挑战，在最近的一篇文章中发表了3a的冷冻电镜结构结构与分子生物学文章．通过利用脂质纳米片，他们能够分离单个3a蛋白进行单颗粒分析，确定其结构为2.1 Å分辨率。这种程度的细节使他们能够可视化内部极性腔和外部亲水凹槽，这是两个潜在的治疗兴趣离子转导区域。3a样蛋白在冠状病毒中的流行使这些观察结果成为针对SARS-CoV-2和类似疾病的替代靶向治疗的令人兴奋的第一步。

结构生物学的未来

冷冻电子显微镜正在革新结构生物学，用长期以来被认为站不住脚的新见解支持了现有的方法。随着研究人员开始弥合细胞和分子见解之间的差距，他们可以概念化蛋白质功能如何与细胞行为和最终生理学相关。正如我们在抗击冠状病毒的斗争中已经开始看到的那样，这些观察结果可以导致对疾病和失调的高度精确、有针对性的治疗方法的发展。这是结构生物学中激动人心的关键时刻低温电子显微镜正在成为一个主要的参与者．

作者简介:

Abhay Kotecha他是赛默飞世尔科技公司应用科学家经理。
亚历克斯Ilitchev是赛默飞世尔科技公司的首席科学编辑。