低温电子显微镜为蛋白质纳米机器提供了结构蓝图

在分子水平上，生物体的生理功能在很大程度上是由它所表达的蛋白质决定的，在大多数疾病的情况下，功能失常的蛋白质可以被确定为根本原因。

对于任何“损坏”或发生故障的对象，要找到问题的根源并修复它，我们必须了解它是如何构建的，以及对其功能有贡献的各个组件。低温电子显微镜(cryo-EM)可以帮助我们破译蛋白质等重要细胞机制的结构生物学。

我们采访了克里斯蒂娜Paulino高分辨率低温电子显微镜助理教授格罗宁根大学，以了解低温电镜在她的小组研究膜蛋白结构和功能的工作中所起的作用。

莫莉·坎贝尔(MC):为什么了解膜转运蛋白的结构和机制很重要?你通常研究哪些特定类型的膜转运蛋白，为什么?

克里斯蒂娜·保利诺:了解蛋白质的结构是揭示蛋白质作用机制的基础。当结合功能和生理数据时，我们能够详细了解这些蛋白质是如何运作的，它们为什么以及如何故障，疾病的原因是什么以及我们如何解决它。我喜欢把蛋白质结构比作一台组装机器的蓝图。虽然遗传学和生物化学有助于理解蛋白质的生理作用，但结构生物学揭示了这些纳米机器的样子以及它们是如何连接的。只有这样，我们才能理性地理解它们，并利用这些知识来修复、设计或阻止它们，例如，通过制造只适合这一特定机器的药物(基于结构的药物设计)。

我的研究重点是阐明嵌入膜中的蛋白质的作用机制，特别是膜转运蛋白和膜通道。尽管膜蛋白具有很高的药理学相关性(目前市场上60%的药物都是针对膜蛋白的)，但人们对膜蛋白的结构-功能关系知之甚少，需要在生物学、化学和物理学的界面上采用跨学科方法。

虽然我的团队主要是由这些蛋白质如何工作的基本问题驱动的，但结果可能有额外的社会经济应用。这在我们对人类的研究中得到了证明ASCT2谷氨酰胺是人类细胞摄取谷氨酰胺的主要来源，它与癌细胞生长、患者生存率差密切相关，也是癌症治疗中的一个新的热门靶点。除了阐明其转运机制的细节，我们还与药物化学家合作，确定新的抑制剂，并指导基于结构的药物设计。其他研究模糊了经典输运机制中存在的传统概念界限。例如，细菌中的一种紧急钾吸收系统KdpFBAC复合物结合了主活性转运蛋白和通道的特征。在TMEM16家族中，成员可以作为钙激活的氯通道或脂质打乱酶，甚至两者兼而有之。我们的研究表明，在进化过程中，保守蛋白结构不仅彼此进化，而且可以合并在一起，以适应不同的环境和细胞需求。

MC:低温电子显微镜对你的工作有多重要?这对你的团队的能力有什么不同?

CP:在过去的几年中，低温电子显微镜已被证明是结构生物学中不可或缺的技术，与x射线晶体学相比，它有几个优点，即(i)只需要少量的蛋白质;(ii)不受蛋白质晶体形成的限制;(iii)几乎不受缓冲成分的限制，并允许在冻结前诱导构象变化;(iv)不受样品成分或构象异质性的限制，可以窥见结构动力学;(v)能够确定低分辨率和高分辨率结构;并且(vi)允许使用模拟原生脂质环境的工具，如纳米盘。值得注意的是，虽然使用低温电镜获得的分辨率平均低于x射线晶体学，但膜蛋白获得的常见分辨率是相似的(约3-4 Å)。这些优势已被证明是解决膜蛋白工作时面临的几个挑战的关键，允许进行前所未有的研究，并使冷冻电镜经常成为研究膜蛋白结构的首选技术。因此，低温电镜是我的小组采用的主要技术。

MC:使用低温电子显微镜推断膜蛋白结构的典型时间框架是什么?

CP:在一个完美的世界里，有一个完美的样品，有一个对准良好的高端显微镜和强大的图像处理集群，人们可以在几天内解决一个高分辨率的结构。然而，在现实中，特别是在处理具有挑战性的膜蛋白时，时间框架通常是几周和几个月。

MC:您最近使用低温电镜(cryo-EM)来确定TMEM16蛋白家族的结构。在一份新闻稿中，你说这种方法“允许你对主动结构的动力学进行采样”。你能详细说明一下吗?为什么低温电子显微镜优于其他可用的方法?

CP:低温电子显微镜的优点之一是样品是冲击冷冻的，保留了溶液中存在的所有构象。这与x射线晶体学形成了强烈的对比，在x射线晶体学中，根据定义，晶体中的所有蛋白质都处于相同的状态，通常仅限于能量上有利的构象。此外，我们可以在图像处理水平上处理低温电镜图像中存在的构象异质性。因此，人们可以从同一样品中确定溶液中蛋白质的几种结构，代表不同的功能状态。在我们最近对脂质扰变酶TMEM16的研究中，我们能够在激活条件下获得该扰变酶的几种结构。我们将这些不同的构象解释为蛋白质逐步激活机制的快照，并提出其中一种中间状态可能是在某些TMEM16蛋白中观察到的非选择性离子传导的原因。

MC:在你的研究领域使用低温电镜有什么限制吗?如果是这样，如何克服这些限制呢?

CP:在过去的几年里，见证低温电镜技术的发展是多么迅速，多么令人兴奋。虽然这项技术正在不断地重新定义其局限性，并变得更加用户友好，但我们仍然面临着一些挑战。对于x射线晶体学来说，获得完全可操作和维护的同步加速器束流线基本上是免费的，但低温电子显微镜的总体成本和操作显微镜所需的专业知识水平一直是一个障碍。政府资助的低温电镜设施的实施在一定程度上解决了这一问题，但并非完全解决了这一问题。

在我的小组中，我们有一台内部高端显微镜供我们使用，我们确保对所有小组成员进行彻底的培训。其他障碍包括图像处理集群的访问和成本、数据管理(每天可以记录几tb的数据)以及图像处理方面的专业知识。幸运的是，IT成本随着时间的推移而下降，图形处理单元驱动软件的实现使成本可以承受。当然，样品制备还有很大的改进空间(例如，所需的蛋白质更少，避免空气-水界面)，几个小组和公司正在研究这个问题。

最后，解决结构所需的总时间，以及尺寸和平均分辨率的限制，仍然是一个挑战，阻碍了基于结构的药物设计所需的高通量方法。这些问题正在通过更稳定的电子显微镜、更好、更高效的电子探测相机和改进的处理算法的结合来解决。

克里斯蒂娜·保利诺接受了科技网络科学作家莫莉·坎贝尔的采访。188金宝搏备用