低温保存:应用与进展

多年来，低温保存一直是保存生物标本的主要方法。它允许研究人员使用几十年前的稀有或珍贵样本来回答新的研究问题。今天，它被用来保存最新的复杂细胞模型，供其他科学家在未来使用，对生物治疗的储存和供应至关重要。在这篇文章中，我们探讨了低温保存的挑战以及可以改进这些方法的新兴进展。

什么是低温保存?

Cryo是希腊语中“霜”的意思低温贮藏从字面上讲，包括在非常低的温度下冷冻细胞、组织、器官或任何其他生物材料。

有几种方法可以实现这一点:在研究实验室中最常用的方法是使用固体CO在-80°C冷冻样品₂或- 196°C使用液氮。但一种被称为玻璃化的方法被用于冷冻临床样本，如精子、受精卵或卵巢组织，以进行长期储存。主要区别在于传统的低温保存方法允许在保存过程中形成冰，而玻璃化则使整个溶液凝固，没有任何冰结晶。¹在这篇文章中，我们将重点介绍最常用于实验室的传统冷冻保存。

低温保存的应用

传统的冷冻保存是一种非常有效的储存细胞和组织的方法，其工作原理是使细胞处于“假死”状态 ——伊克巴尔威康桑格研究所的生物资源经理解释道。“通过冷冻细胞，它可以停止代谢活动，并保存细胞内的化合物，如酶。”

如果没有冷冻保存，你必须让细胞和组织在持续培养中存活——这意味着生长和分裂它们以产生更多的细胞(称为传代)。但随着时间的推移，细胞会随着繁殖而发生变化，这可能会导致它们失去重要的特征。通过冻结它们，它减少了非均质性，否则将通过重复传递它们而引入。

“从我们的角度来看，低温保存可以让我们为研究界储存新的细胞模型，人们可以在未来几年里使用它们，”他说夏洛特·比弗博士他是威康桑格研究所的高级科学经理，开发了复杂的细胞模型系统，如类器官。“这意味着我们可以长期保持模型，但它们不会持续分裂到几乎不能代表你开始时的细胞的程度。”

低温保存变得越来越重要的一个领域是快速崛起的领域细胞疗法:例如，保存间充质干细胞用于移植，或嵌合抗原受体T细胞(CAR - T细胞)用于治疗癌症。通过CAR-T细胞疗法，患者的T细胞被移除，重新设计以识别抗原(如肿瘤相关抗原)，然后恢复到它们身上。“你必须对这些细胞进行大量的处理，可能会在不同的位置移动细胞，在患者捐献给实验室时从患者那里获得细胞，然后再次返回患者，细胞很容易降解，”解释说Matthew Gibson教授华威大学的生物材料科学家。“理想情况下，这样的治疗方法需要冷冻，让你在床边迅速解冻，然后再给病人服用。一旦你不得不在医院进行大量的处理，就会产生障碍，所有这些步骤都会带来巨大的成本。无论如何，这些都是非常昂贵的治疗方法，所以任何使这一过程更有效并在冷冻后获得更多健康细胞的方法都对患者有好处。”

低温储存动物细胞培养物

保持健康、生长的细胞培养是一项艰巨的任务，由于事故或污染而导致细胞损失的风险一直存在，这使其变得更加困难。这些问题可以通过低温保存来减少，这个过程可以有效地使细胞进入真正的假死状态。下载本指南以发现细胞冷冻过程中的细胞内和细胞外事件以及冷冻细胞培养的优点。

下载指南

赞助内容

低温保存的局限性

目前冷冻保存方法的主要局限性之一是冷冻后细胞的回收率。虽然在研究项目中，你可能有时间等待你的细胞数量增长，但对于上述临床应用来说，这是不可能的。

在冷冻过程中，样品内部会形成冰晶，破坏细胞，有些细胞永远无法恢复。大多数实验室和临床方案使用冷冻保护剂来保护细胞免受冰晶和/或控制速率的冷冻和解冻，以避免细胞受到温度突然变化的冲击。

有许多不同的冷冻保护剂，但最常用的用于哺乳动物细胞和组织的冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)。其他选择包括用于细菌细胞和红细胞的甘油。但是冷冻保护剂也有自己的缺点;DMSO被认为是最好的保护剂，但在一定浓度时，它对细胞是有毒的 ．与DMSO相比，甘油对细胞更友好，但作为冷冻保护剂效果较差。²减轻潜在毒性问题的一种方法是使用不同的冷冻保护剂组合，例如用甘油或聚丙烯乙二醇补充较低浓度的DMSO。²

还有一些初级细胞类型不喜欢在冷冻保护剂溶液中冷冻，这可能是一个挑战。伊克巴尔解释说:“急性髓系白血病外周单个核细胞比淋巴瘤细胞更容易冷冻和恢复，所以如果你在冷冻样本时还不知道恶性肿瘤是什么，那么你需要非常小心地对待它们。”“同样，不同类型的健康血细胞冷冻方式不同——T细胞可能恢复得很好，尽管它们的功能可能会受到影响，而粒细胞则完全不会恢复。”

“有了新的复杂模型，比如从患者样本中提取的类器官，我们就有丢失模型的危险，”比弗解释说。“使用类器官的优点之一是，它们由不同的细胞群组成，代表了你在组织或肿瘤中看到的自然异质性。冷冻会使它们遇到瓶颈，如果这个瓶颈对某些细胞来说太苛刻，你就会失去这种异质性，它就不再是一个很好的模型了。”

另一个需要考虑的问题是样本的最终用途。例如，RNA比基因组DNA对温度变化更敏感，正如比弗所说:“人们多年前就挖出了骨架，仍然设法对所有DNA进行测序，而RNA如果在- 80°C的冰箱中被打开太多次就会降解!”如果你还不知道如何使用它们，这就给冷冻样本带来了一个问题。

伊克巴尔说:“如果你的组织非常有限，随着分析方法的改进，你必须决定保存这些材料的最佳方法是什么。”“我记得大约18年前我开始工作的时候，我们会进行非常大的淋巴结活检，其中的组织数量超过了我们可能使用的数量，因此能够以多种方式保存，而现在核心活检普遍用于诊断，因此用于研究目的的保存材料非常有限。”

细胞低温保存的基础知识

低温保存已成为生物医学研究和临床医学的常规做法。当冷冻和妥善保存时，标本可以无限期地保持暂停细胞代谢的状态，并可以根据需要解冻。为了获得这一过程的好处，对低温保存的关键方面有一个全面的了解是很重要的。下载本指南，了解细胞冷冻保存的基础知识，供研究和临床使用。

下载指南

赞助内容

低温保存的进展

比弗说，有两个主要的进展可以改善低温保存。“中档自动化是市场所缺少的。即使你只冷冻30到50瓶东西，而且不一定是每天都冷冻，对实验室里的人来说，这仍然是一个人体工程学上的挑战。”除了机器人，另一个需要改进的领域是寻找DMSO的替代品，DMSO可能对细胞有害。胎牛血清通常与DMSO一起使用，以提供进一步支持细胞的蛋白质。但这对于冷冻干细胞来说并不理想。“如果活细胞按照你不希望的方式分化，那么拥有活细胞就没有意义了。如果你将这些细胞注射回这些人体内，例如进行细胞移植，那么你就需要一种非动物来源的血清替代品。”

“基于dmso的低温保存是一个很好的方法，但我们真的需要考虑事情的效率，”吉布森同意。“对于很多类型的细胞，我们通常使用标准方法冷冻，冷冻后可能只能得到20%到60%的细胞。如果我们能得到更高的数字，那么我们要么可以从冰箱中取出小批量的细胞，要么使用更难培养和扩增的稀有细胞或原代细胞，那么你恢复的越多，你就能越快地进行研究，或者每批实验就能做越多。”

为了满足这一需求，吉布森正在研究仿生材料，他们一直在模仿的一种蛋白质被称为防冻蛋白，或冰结合蛋白。^3.“这些蛋白质以某种方式能够选择性地与冰结合。它们能区分液态水和冷冻水——这是非常了不起的。”这些冰结合蛋白是由各种各样的物种产生的，最著名的是在地球两极发现的鱼类。蛋白质结合冰晶阻止它们生长，这样鱼就能在比没有蛋白质的鱼更低的温度下生存。“事实证明，有相当多的蛋白质和多糖可以制造或阻止冰的形成，或者控制冰的形成方式和时间。如果我们可以用合成聚合物模仿这一点，那么我们就可以改变冷冻细胞的方式，灵感来自大自然在寒冷中保护自己的方式。”研究小组已经证明，在冷冻细菌细胞时，他们可以使用聚合物来减少冷冻保护剂的用量。⁴

吉布森说，另一个进步是能够冷冻已经附着在组织培养板上的细胞。“对于悬浮细胞，你必须把它们放在盘子上，让它们生长，然后才能使用它们。我们感兴趣的是如何在这些平板上冷冻细胞，这样你就可以把它们从冰箱里拿出来，随时可以使用。”吉布森的实验室已经开发出了一些材料，它们不是通过影响冰来起作用，而是通过在冷冻过程中有效地保护细胞来起作用。⁵“我们发现这些细胞恢复水平非常惊人。我们最令人兴奋的结果之一是通过向单层细胞中添加聚两性电解质，附着在组织培养塑料上，我们看到细胞的回收率从< 20%急剧增加到80%。”⁶

这项关于冷冻科学的研究也不仅仅局限于生命科学，它还被应用到方方面面，从让冰淇淋吃起来更奶油，脂肪更少，到避免冻融对混凝土的破坏。⁷

“如果你能让研究更有效，这是一个伟大的结果，但这样的研究也有助于解决这些低温如何影响生命，以及我们如何更好、更有效地储存东西的基本问题。”

参考文献

1. 杜武库格鲁，阿扎维，卡其AA，哈萨尼S，等。是玻璃化冷冻保存的标准方法。中东Fertil。Soc。J。2012; 17:152 - 156。doi:10.1016 / j.mefs.2012.07.007．

2. 阿旺M，布里亚克B，弗莱克R，等。二甲基亚砜:自低温生物学诞生以来一直是核心成分，其功效是否与毒性相平衡?再生医学2020;15 (3) doi:10.2217 / rme - 2019 - 0145

3. 抗冻蛋白在低温保存过程中调节细胞存活:通过影响冰晶生长进行调节。美国国家科学研究院．1992; 89(19): 8953 - 8957。doi:10.1073 / pnas.89.19.8953

4. Hasan M, Fayter AER, Gibson MI.冰再结晶抑制聚合物使微生物无甘油低温保存。《生物高分子2018; 19(8): 3371 - 3376。doi:10.1021 / acs.biomac.8b00660

5. 斯塔布斯C，贝利TL，默里K，吉布森M.聚两性电解质作为新兴的大分子冷冻保护剂。《生物高分子7 - 17 2020; 21(1):。doi:10.1021 / acs.biomac.9b01053

6. Bailey TL, Stubbs C, Murray K, Tomás RMF, Otten L, Gibson MI.合成可扩展的聚(两性电解质)，显著提高细胞低温保存。《生物高分子2019; 20(8): 3104 - 3114。doi:10.1021 / acs.biomac.9b00681

7. Frazier SD, Matar MG, Osio-Norgaard J, Aday AN, Delesky EA, Srubar WV。通过模仿自然的防冻剂来抑制水泥膏体和混凝土的冻融损伤。细胞报告物理科学2020; 1:100060。doi:10.1016 / j.xcrp.2020.100060．