DNA合成:方法、进展和应用程序

To兑现的承诺的新生物制药,合成生物学极度依赖于先进的DNA合成方便,便宜和快速获得准确的核酸序列。

创新的新方法和发现下一代DNA测序(上天)和分子生物学从根本上重新定义阅读和编辑DNA的机遇和挑战,但写作进步DNA增量相比之下。

标准DNA合成,包括当前最先进的芯片平台技术为基础,继续依靠一个40岁的phosphoramidite化学。这项技术不能提供长(> 150个核苷酸)DNA所需的足够的质量和数量满足需求的新兴生物制药及合成生物学的应用。在本文中,我们反思写作DNA和最先进的方法主要为未来的DNA合成技术的发展方向。

DNA合成化学的历史

核苷phosphoramidite前体和坚实的支持方法,发达国家在1980年代早期在博尔德的科罗拉多大学的,使DNA合成过程的自动化和商业化,导致合成寡核苷酸的普及。寡核苷酸和合成DNA是现在必不可少的一部分的方方面面,最近的生物制药发展和其近亲合成生物学。

化学DNA合成方法的成功已经成为了一种现象,并提出了更高的吞吐量,减少试剂消耗,降低成本。然而,通过phosphoramidites DNA合成化学本质上是有限的。即使反应通常每构建块进行> 99.2%的耦合效率,快速的迭代过程提供DNA产量递减和高复合错误率在> 100个核苷酸的序列长度。这些限制,加上恶劣的试剂和反应条件,突出使DNA合成方法的必要性。

一个酶的方法

幸运的是,template-independent DNA合成成立于自然。作为脊椎动物免疫反应的一部分,末端转移酶(TdT)聚合酶驱动高效随机聚合的脱氧核苷三磷酸构建块在“先来先得”的基础上。的特定DNA序列的可控合成实验室,一样可以使用负催化剂结合四个可逆终结者三磷酸脱氧核苷酸类似物(核苷酸)。过程有点类似于综合排序(SBS)中使用几个平台的可逆终结者核苷酸类似物使控制逐步扩展的一个用户定义的特定序列的方式启动底漆。与下一代SBS不同,该方法不需要模板核酸和有能力新创合成。经过多个周期的延长和终结者、完整的长度,单链polydeoxynucleotide裂解的坚定支持和孤立的后续使用。由于DNA是通过酶的合成过程中,它的存在是一个完全自然的,生物活性分子;从而消除一些耗时和modification-inducing化学操作所需phosphoramidite DNA合成的方法。

在酶DNA合成的挑战和解决方案

除了明显的想搬到一个更快、更便宜、更环保的方法,时间长度和高纯度寡核苷酸是一波又一波的新技术发展的目标是全面的科学界。尽管它组装短的寡核苷酸(即技术上是可行的。,< 100核苷酸)双链结构的基因长度,TdT-driven长的DNA序列的合成加速装配过程。未来发展的方法甚至可能促进整个基因的直接合成和基因簇。简化post-synthesis过程将导致更低的成本和更快的周转时间。此外,有申请单链DNA纯度较高(ssDNA)分子超过目前在经济上可行的,也许是最令人兴奋的应用程序是使用同源性定向修复的ssDNA CRISPR-Cas基因组编辑。

酶DNA合成的成功取决于两个截然不同但又相互依赖的元素:一个有效的聚合催化剂和可逆的核苷酸(生物)。本机tdt)提供了许多必要的品质作为酶合成的引擎基于几个有据可查的结合属性的酶。首先,能够扩展引物附近定量的方式导致的,成千上万的核苷酸第二,接受各种各样的修改和替换核苷酸类似物作为有效的基质。

TdT-driven DNA合成的效率自然也提出了一个关键的挑战:添加一个控制,且只有一个,每周期核苷酸。经典的解决这个问题的方法是使用一个可逆终结者的3 ' -哦控制添加核苷酸。不幸的是,大量的负公差变化nucleobase不扩展到修改的糖部分可逆的终结者核苷酸。因此,新的挑战酶合成的发展是平衡的选择3 '可逆的终结者,既是有效负衬底,在温和条件下快速移动。通过合并的创造力,经验和专业知识的工程师、化学家和蛋白质改性的新型组合核苷酸和定制tdt)正在开发调整这个DNA合成“引擎”和兑现的承诺写DNA高效、经济。

未来的前景

酶合成的DNA是在它的技术生命周期的开始。有巨大的进步,在商业这一技术的实现。新硬件和高性能酶长保质期,两个名字,都是酶DNA合成的未来发展的一部分。技术的多功能性尚未完全证明或探讨。一个明显的例子是大规模合成的核酸疗法,农业和核酸的材料。潜在的回收反应物为多个周期会产生戏剧性的影响等合成的成本;目前,这个机会不存在化学合成。另一个例子是DNA的新兴应用信息存储系统。未来的DNA“硬盘”代表着无限需求较大的合成DNA生命科学应用程序相比,酶DNA合成的要求替代实现,专注于降低成本和更高的吞吐量,同时保持忠诚。像硅加快了计算创新、酶DNA合成的关键可能是下一个时代的技术进步。 It promises to finally bring “writing” on par with reading and editing DNA.

写的 威廉j . Efcavitch博士联合创始人兼首席科学官分子组装和斯特凡·鲁茨博士,高级副总裁、研究,Codexis公司。