液滴数字PCR检测基因治疗过程中的支原体

近三分之一世界上大部分的细胞系都被支原体属的细菌污染了。长期以来，这些细菌一直是分子生物学家的烦恼影响几乎所有方面的细胞生理和经常影响研究结果。但现在基因疗法正在进入临床，支原体威胁着研究成果而且病人的生命。

今天，大多数基因疗法使用腺相关病毒(AAV)作为其核酸传递载体。aav在细胞培养中生长，自支原体细菌通常存在于细胞培养中，基因治疗批次容易受到污染。如果这些细菌在基因治疗生产的早期没有被发现和筛选出来，它们就会接触到患者。

一种支原体，m .肺炎是致病的。这个物种导致约200万例细菌性肺炎100000人住院每年。一些生物学家称之为细菌的“野草”因为它无处不在，很难发现，也很难在病人身上治疗。

随着越来越多的患者接受aav治疗，这种细菌物种可能会影响更多的生命。因此，生物制造商在整个开发和生产过程中需要灵敏的工具来检测支原体，以确保细菌不会接触到患者。

检测和移除的挑战支原体

支原体细菌无处不在，从动物来源的细胞培养基到实验室外套，很容易逃避检测。T它们的直径只有2-3微米，太小了，无法通过标准光学显微镜镜头看到。它们是如此之小，以至于它们可以出现在细胞培养上清液中，浓度高达每毫升107个细胞不影响文化的外观。

即使被发现，支原体细菌也很难从细胞培养物中去除。因为它们是革兰氏阴性菌，所以它们对科学家通常用来清除细胞系细菌污染的β -内酰胺抗生素具有耐药性。机械分离也是一个挑战，因为它们的体积小，很容易通过过滤器。

科学家们转而求助于直接检测支原体，这是他们筛选出受污染基因治疗批次的唯一希望。传统上，科学家使用各种方法用肉汤或琼脂检测这些细菌的菌落生长，染色或标记其遗传物质，或寻找支原体蛋白。但这些方法可能需要长达一个月的时间才能产生效果，这可能会严重减缓制造速度。定量PCR (qPCR)可以在一天内检测出支原体，但该工具使用标准曲线来估计样本中的支原体水平，这造成了可变性，降低了该技术的灵敏度。

液滴数字PCR为mycoplasma检测工具

滴滴数字PCR (ddPCR)技术也可以快速提供结果，但与qPCR不同的是，ddPCR直接测量支原体水平，使其更加敏感。

ddPCR技术涉及将一个10 μ L的核酸样本分割成20,000个均匀的1-nL液滴，并在每个液滴中进行单独的反应。由于每个液滴只含有一个或几个核酸链，这种技术使研究人员能够同时对单个DNA链进行数千次端点PCR。含有目标序列的液滴在PCR扩增时会发出强烈的荧光信号，而不含目标序列的液滴只会发出微弱的荧光。使用泊松统计，该软件计算阳性和阴性液滴的数量，从而得出原始样品中目标核酸的浓度。

ddPCR检测使用探针化学，使用三种引物，与qPCR相比，减少了非特异性DNA扩增的发生。通过以这种方式量化支原体DNA，生物制造商可以更确定支原体的存在或不存在支原体并提供更安全的基因疗法。

在一个最近的研究，研究人员测试了ddPCR技术检测支原体的敏感性和特异性。研究小组研究了自然界中发现的三种典型物种:答:laidlawii，m .肺炎,m . hyorhinis。他们发现这三种的检测极限(LOD)一直很低答:laidlawii为4.19个基因组拷贝(GC)/m .肺炎是6.29 GC/well，这是为了m . hyorhinis为5.63 GC/well。其实在直接对比中，ddPCR技术检测到了答:laidlawii1菌落形成单位/mL的标准，而qPCR没有。

这些研究人员还通过比较三种支原体物种的检测与三种对照物种的检测来测试交叉反应性:c . sporogenes，l .嗜酸的，而且美国宝。他们证实他们的ddPCR方法只检测支原体。

对m的需求日益增长ycoplasma基因治疗开发中的测试

随着基因疗法进入临床，困扰实验室研究的一些污染挑战也随之出现。例如，由于一些支原体物种会导致人类疾病，基因疗法在给患者使用之前必须对支原体进行筛查。尽管基因治疗的发展很复杂，但今天的生物制造商已经获得了他们需要的工具，以确保他们的治疗质量。ddPCR技术就是其中一种工具，它很可能在确保基因疗法对每个人都安全有效方面发挥重要作用。