确保重复性:关键的细胞培养质量控制

细胞培养是必不可少的在体外实验工具。在一个盘子里再现人体二维和三维的尝试，为数十年的研究提供了基础，可能还为成千上万的博士提供了基础。然而，当它出错时，无论是由于意外、感染、错误鉴定、交叉污染还是不受控制的分化(对干细胞而言)，都可能会非常紧张，尤其是在长期实验或使用难以替代的细胞系时。另一个重要的考虑因素是可重复性，这是一个公认的生命科学行业问题。一个2015公共科学图书馆生物学例如，一项研究在对以往研究的分析中报告称，不可重复研究的流行率超过50%——相当于每年用于不可重复临床前研究的280亿美元。¹在这方面，细胞培养方法的不一致性是一个潜在的问题，因为如果细胞没有以一致的方式维护或使用，或被感染(如支原体)污染，这可能会对结果产生负面影响，并使复制和/或准确解释数据更加困难。

“质量控制(QC)是确保任何细胞培养过程输出质量的关键部分，是确保研究中科学质量的可重复性以及保证细胞培养衍生产品的质量和安全的重要部分，”评论道Glyn N Stacey国际干细胞库计划，英国剑桥，中国科学院干细胞与再生研究所和国家干细胞资源中心，中国北京。“这些话题目前在期刊编辑、研究资助者和监管者的脑海中非常重要，因此对研究人员具有至关重要的意义。”

本文将探讨细胞培养质量控制的这些不同方面，以及可以实施的协议类型，以帮助确保可靠和可重复的结果。

预防感染

在细胞培养过程中会发生一些不必要的感染，通常是在细胞分离、常规处理或实验设置期间引入的。这包括细菌、酵母、其他真菌/霉菌以及支原体和病毒。化学污染，包括金属离子和内毒素也会对细胞产生影响体外。讲究使用无菌方法可以带来巨大的回报，节省大量的时间和资源，²但还有其他类型的质量控制问题，科学家必须保持关注，包括细胞错误识别和交叉污染。关于感染的话题，Stacey说:“微生物状态评估应该包括支原体检测，检查细菌或真菌污染，原始库存也应该评估和/或测试可能的病毒污染物。”

露丝泥炭英国伦敦克里克研究所(Crick Institute, London)细胞服务部门的负责人，她强调，在她的实验室里，“我们(根据我们的经验)取得的唯一成功是‘治愈’了支原体细胞系。有已知的商业制剂可用于治疗支原体。这是一个漫长的过程，对我们来说，我们的协议意味着一个细胞系将接受12周的治疗和隔离。”Peat补充了以下警告:“支原体可能具有耐药性，但并不总是可治愈的——某些细胞不容易治愈支原体，因此将被丢弃。”

你的细胞系和你想的一样吗?

Horbach等人的一项研究表明，超过3万项研究报告了错误识别细胞系的研究。^3.据估计，15%或更多的人类细胞系不是来自声称的来源，尽管这个问题在1967年首次报道，但它似乎是一个反复出现的问题。^4，5认错只是几个相关问题之一。跨细胞系的交叉污染，包括来自不同样本(在原代细胞的情况下)，或不同细胞类型甚至物种的交叉污染是另一个重要的挑战。当使用简单的光学显微镜观察时，它可以完全摆脱结果，并且不会被发现。负责任的细胞培养实践可以显著降低和/或防止此类危机的可能性，这对开展可重复的科学至关重要。

Peat评论说:“DNA样本被用于质量控制测试，以确保细胞系是真实的。一个细胞系与另一个细胞系混合被视为污染物，任何被发现混合的细胞系将被毫无疑问地丢弃。这将使用于研究的细胞系的质量保持最高标准。”

短串联重复(STR)分析是一种用于验证细胞系的关键方法。的美国国家标准协会已经提供了可以帮助证明人类细胞系真实性的协议，国际细胞系认证委员会(ICLAC)也就这一主题提供了指导。Peat建议对人类细胞系使用STR分析可以与Expasy细胞系知识资源中的特征进行比较，Cellosaurus．如果这种类型的测试是不可用的，例如当从其他物种的细胞系工作时，Stacey建议使用COX-1基因序列来确认身份，至少在物种起源的水平上。⁶

细胞功能，干细胞和受控分化

干细胞(SCs)包括诱导多能干细胞(induced pluripotent Stem cells)在改变临床治疗方面具有巨大潜力，包括在再生医学等领域的应用。然而，确保SCs的高质量来源(包括使用前的表征)至关重要，因为质量和流程因实验室而异，包括收集、检疫、银行、命名、表征、运输以及文件和数据管理等基本要素。这就是为什么欧洲诱导多功能细胞银行(EBiPSC)建立了标准化的质量控制制度，包括1)严格的放行测试;2)信息测试和3)“适合用途”的质量管理体系，支持可追溯性和持续发展，基于DIN ENISO9001:2015全面质量管理标准。⁷

Stacey认为常规观察未分化的干细胞培养应该有助于发现典型干细胞集落形态的实质性变化。⁶然而，如果一部分菌落表现出改变(分化)的形态，有可能选择性地分离未分化的干细胞并继续培养它们，“尽管这并不理想，”他补充道。

确保与实验设置一致

一般来说，在实验室中有多少细胞培养是统一进行的?不同的科学家在方法和/或实际技术上可能会有细微的差异，这在过去可能被归因于它是一门“艺术”而不是一门科学，但不同个体的结果如何相互比较呢?不幸的是，任何差异都可能导致结果的差异，包括细胞培养基、播种密度、胰蛋白酶化时间——甚至是细胞生长的表面/材料。下面的一些建议可能会有所帮助。

QC之路

严格的标准操作程序(SOPs)的使用，加上在培训和提前准备方面的投资，可以对细胞培养的整体QC产生重大影响。Stacey推荐了一种“预防胜于治疗”的方法，包括:

• 对所有细胞培养人员进行无菌技术培训
• 细胞培养工作与一般实验室工作和实验室走道分离
• 实验室新细胞系的隔离
• 所有细胞系冷冻保存的常规制备及其质量控制
• 常规的细胞培养柜测试和清洗
• 定期的实验室清洁制度，包括每日清除废物^8，9

1.标准作业程式

标准操作程序应在实验室或研究所的所有用户中推广标准化的细胞处理实践，并鼓励仔细、定期记录和维护准确的文件。这有助于提高结果的质量并使其更加可靠。为了预防感染，这可能包括关于无菌方法使用的非常具体和详细的指导方针，在细胞处理之前、期间和之后应采取的预防措施，以及所需的设备和试剂。在记录保存方面，Peat分享了克里克研究所的细胞服务团队为每个细胞系保存了出色的记录，使用冷冻库存跟踪系统，并在细胞系恢复后完成生长表。研究小组还保存了传代数量的记录，并确保细胞系每次生长的时间不超过6-8周，之后从冷冻的库存中恢复新的细胞供应。

2.培训

确保所有细胞培养操作人员都经过相同水平的培训是至关重要的，因为如果一个人的操作低于要求的标准，就可能会引入潜在的感染或其他问题。“重要的是要意识到潜在污染的原因(例如，错误标签培养，粗心或笨拙的细胞培养操作)，随后确保所有用户都接受了无菌技术和良好的细胞培养实践的培训，”Stacey说。^9，10Peat强调优秀技术的重要性，牢记重要的步骤，例如在层流罩中一次只使用一个细胞株，绝不在细胞株之间共享介质、溶液或移液管。

3.提前为实验室工作做好准备

确保你需要的一切都提前准备好了，并且在细胞培养罩附近，这是防止混淆或引入污染的一个简单方法。这包括预先对脚手架、仪器和试剂等设备进行消毒，并确保手边有移液枪、一次性移液器和利器和/或生物危害垃圾箱等其他工具。一个保持清洁，没有多余物品的工作台或手推车非常适合这个目的。不溶于乙醇或干燥的永久性记号笔也很有用，可以确保任何塑料盘子/样品都标有非常清楚的信息，如细胞系、具体的样品信息、最后一次传代的日期和/或实验设置以及任何其他值得跟踪的信息。写在盘子上的内容应与实验室笔记/文件相协调，后者应仔细跟踪信息。在英国，应遵循人体组织管理局(HTA)的行为规范和标准，以确保与科学家的特定工作和使用人体组织和/或细胞相关的管理立法得到遵守。¹¹

4.常规监测

斯泰西建议科学家定期通过显微镜观察他们的培养物。“这是监测不良事件(如污染或形态变化)证据的重要方法。”他补充说，通过日常检查，用户可以避免在不知不觉中培养出压倒性的感染，然后传播到其他文化的风险。

向上和细胞培养

密切关注细胞培养QC不仅有助于加速研究，帮助消除不必要的压力和实验和/或资源的损失，因为糟糕的计划和/或缺乏标准的QC流程，它还可以提高可重复性，从而提高实验结果的长期相关性。负责任的科学首先关注一致性和可靠性，有助于提高利用细胞系进行的生物医学研究转化为有用的、成功的临床治疗或工具的可能性。

参考文献

1.Freedman LP，等。临床前研究的可重复性经济学。公共科学图书馆杂志．2015;doi:10.1371 / journal.pbio.1002165。

2.Kalia P.去风险细胞培养:小心处理污染。188金宝搏备用技术网络。//www.dile1000.com/cell-science/how-to-guides/de-risking-cell-culture-getting-canny-with-contamination-351546．2021年8月3日出版。2021年9月27日访问。

3.Horbach SPJM, Halffman W.海拉的幽灵:细胞系错误鉴定如何污染科学文献。PLOS One。2017; 12日1 - 16。doi:10.1371 / journal.pone.0186281

4.大师j，结束假细胞系的丑闻。大自然。2012年,492年，186.doi:10.1038 / 492186．

5.美国类型文化收藏标准开发组织工作组ASN-0002。细胞系识别错误:终结的开始。巨蟹座。2010; 10，441 - 448。doi:10.1038 / nrc2852．

6.Orla O等人。欧洲诱导多能干细胞银行大规模质量控制的开发和实施。干细胞研究。2020;(45)。doi:10.1016 / j.scr.2020.101773．

7.Stacey GN, Hawkins JR.细胞系:应用和生物安全性。伍利DP，拜尔斯KB，编辑。:生物安全，原则和实践ASM出版社;2016:299 - 326。doi:10.1128/9781555819637. ch14．2021年9月27日访问。

8.斯泰西GN。细胞培养污染。克里族IA。(编辑)在:癌细胞培养。方法和协议，第731卷。胡玛纳出版社;2011:79 - 91。doi:10.1007 / 978 - 1 - 61779 - 080 - 5 - _7．2021年9月27日访问。

9.彭丽娟，李志强，李志强，等。良好细胞和组织培养规范2.0 (GCCP 2.0)——供利益相关者讨论和行动呼吁的草案。ALTEX．37 2020;(3): 490 - 492。doi:10.14573 / altex.2007091

10.张志强，张志强，等．生物医学研究中使用细胞系的指南。Br J癌2014年,111年，1021 - 1046。doi:10.1038 / bjc.2014.166．

11.人体组织管理局。业务守则。2022年9月23日访问。https://www.hta.gov.uk/guidance-professionals/codes-practice-standards-and-legislation/codes-practice