冷冻生命:冷冻保存的当前趋势

低温保存已经成为日常科学研究和许多医学应用中不可或缺的一步，从辅助生殖和移植到基于细胞的治疗和生物标志物鉴定。如果没有这项技术，我们几乎不可能描绘出今天的科学和医学进步。

所有涉及低温保存的治疗和科学发现的成功开发和实施依赖于将该方法从实验室正确和安全地转化为临床和生产规模。

随着正确使用这项技术的需要，更多的研究集中在优化低温保存方法，并调查低温保存材料的生理学的长期影响和后果。

低温保存背后的物理原理

为了修改或排除协议故障，我们首先应该了解它是如何工作的。

低温生物学依赖于非常复杂的物理化学过程和反应，但简单地说，随着温度的下降，细胞外空间的水从液态转变为固态，由此开始形成冰晶。随着水进入晶体，溶质浓度增加，并诱导细胞内部的渗透流出。需要有控制地降低温度，以确保有足够的渗透压差，从而降低细胞内的水位，从而防止在细胞内形成冰晶。冷冻保护剂进入细胞并增加其粘度，从而防止细胞因脱水而收缩 ^{1 ， 2} ．

即使正确和成功地执行，所有这些事件都对细胞有负面影响。脂质膜可被冰晶或温度下降破坏，脱水引起细胞结构变形，冷冻保护剂具有细胞毒性作用。最终，这些会导致解冻后的生存能力和增殖能力下降，但也可能会对细胞的特性和功能造成更深层次和更复杂的干扰。

细胞疗法的成功依赖于良好的低温保存实践

慢速冷冻低温保存是细胞培养保存的黄金标准。尽管这是基础研究中广泛使用的技术，但基于细胞的疗法的兴起带来了许多问题，如该手术的准确性如何，以及在需要符合医学或制造标准时应该考虑多少因素。

成体干细胞是细胞治疗研究的重要组成部分。ASCs可以来自不同的来源，如外周血、骨髓或脂肪组织，并显示出强大的前景，因为它们能够分化成人体的任何类型的细胞。

在最近 工作 ^3. ， 团队 迈克尔胡椒 在 南非比勒陀利亚细胞和分子医学研究所，探索低温保存对脂肪组织来源干细胞(ADSCs)分化能力的影响。在分析了关键脂肪生成基因的基因表达和细胞分化程度后，以高水平的CD36和细胞内脂滴为特征，科学家们报告说，细胞在分离后不久缓慢冷冻冷冻保存不会对其分化能力造成改变。Pepper确信在低温保存重要的细胞池时，有必要进行这样的分析: “对细胞功能进行解冻后分析是至关重要的，以确定低温保存如何影响细胞。”

他的团队正在分析低温保存对其他细胞类型的影响，这些细胞类型主要用于基于细胞的治疗，如血液干细胞和外周血单个核细胞(pbmc)。尽管他们在免疫表型或细胞解冻后的增殖方面没有观察到重大改变，但Pepper表示他担心更微妙的特征可能会受到影响。

正确的冷冻保存用于治疗的细胞是至关重要的。“这一点非常重要，特别是因为细胞可能会在受体体内存活很长时间。这一领域的细胞治疗研究肯定需要更多的关注，”佩珀说。此外，他的话反映了不仅需要评估解冻后的直接恢复，而且需要更深入地研究低温保存可能产生的迟发性影响，并确保移植细胞保留了其治疗特性。

冷冻保存指南-用于研究和临床使用的细胞冷冻保存的基础知识

低温保存已成为生物医学研究和临床医学的常规做法。当冷冻和妥善保存时，标本可以无限期地保持暂停细胞代谢的状态，并可以根据需要解冻。为了获得这一过程的好处，对低温保存的关键方面有一个全面的了解是很重要的。下载本指南，了解细胞冷冻保存的基础知识，供研究和临床使用。

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玻璃化——组织保存的新技术

另一种广泛使用的冷冻保存技术是玻璃化。两种方法之间的选择取决于材料的性质。玻璃化主要用于保存较大的样本，如卵母细胞、胚胎和组织。

与慢速冷冻相比，玻璃化依赖于将材料放入高浓度的冷冻保护剂中并与液氮接触来快速冷冻。这种方法允许水从液态直接转变为固态，而不形成晶体。高浓度的冷冻保护剂防止结冰，因此不需要缓慢冷却。

尽管玻璃化有很大的潜力，但仍有几个参数值得关注。由于高浓度的冷冻保护剂，可以实现快速和剧烈的冻结，但后者也与较高的毒性有关。在某些情况下，另一个限制是样品与液氮直接接触，液氮是病毒或细菌污染的易感性因素。

团队 Christiani阿莫林 比利时鲁汶实验与临床研究所的研究人员正在研究卵巢自体移植中玻璃化的挑战。卵巢自体移植包括保留一块来自癌症患者治疗前卵巢的活跃卵泡的卵巢组织，因为化疗通常对生殖器官有损害作用。该组织样本将被保存，并在患者康复并希望怀孕时自动移植到患者的卵巢上。

在他们最近 研究 ⁴ ， 作者采用了阶梯玻璃化，在此过程中，冷冻保护剂的浓度逐渐增加，同时温度降低。这避免了冰晶的形成，也防止了低温保护剂的毒性。

尽管以前在牛卵巢组织中分级玻璃化得到了很好的结果⁵在美国，人类卵巢组织并非如此。科学家们在解冻后没有检测到正常的卵泡，并将其与高低温保护剂毒性联系起来。事实上，他们观察到所有与二甲基亚砜(DMSO)相关的细胞膜损伤的迹象:显著的细胞器损伤、细胞膜解体和凋亡。这些观察表明，当应用于同一类型的组织，但来自不同的生物体时，该方法可以给出结果的可变性。

阿莫林对他们的方法的未来持乐观态度，并认识到对该主题进行进一步研究的必要性:“我可以看到阶梯式玻璃化方法的巨大潜力，但我 我们也相信，在考虑使用它作为人类卵巢组织冷冻保存的选择方法之前，我们仍然需要学习很多东西。在这种方法中应用的高低温保护剂浓度是我首先关心的问题。我们的研究清楚地表明，50%的DMSO太高了，所以我们需要尝试更低的浓度，或者将其与其他冷冻保护剂结合使用。”

最关键的是最容易被忽视的吗?

这种将生命冻结一段时间并随后恢复的方法，虽然被广泛地、日常地使用，但它所依赖的复杂的物理原理并没有被广泛地理解和考虑。” 大多数使用这种技术的科学家可能对低温保存的物理学了解有限，”佩珀说。 阿莫林在这件事上的看法是一致的: “我认为，作为科学家，我们大多数人都不了解这一过程的复杂性。”

这种全面的有限理解导致了这样一个事实:协议中最关键的点往往是最容易被忽视的。看起来，低温保存中最具挑战性的部分是在超低温下长期储存材料，但实际上并非如此。根据Pepper的说法，冷冻保护剂的类型和浓度以及冷冻时间和细胞数量起着更关键的作用。阿莫林还提醒我们，解冻的步骤经常被忽视。

未来的视角

如果有一件事是我们可以肯定的，那就是低温保存将会继续存在，并且对于未来科学研究和治疗方案的发展是不可或缺的。我们需要解决的问题是如何评估和预防低温保存对生物材料的负面影响。“冷冻保存需要优化，优化技术的标准化将使我们能够比较苹果，并在解释数据时消除潜在的混淆变量。基于有效参数的自动化方法将在这方面有所帮助，”Pepper确信。

阿莫林认为低温保存技术的发展方向是一样的: “我认为第一步是要有一个可靠的程序，然后开发一个可以同时处理多个样本的低温保存机器。”这也暗示了进一步评估低温保存的后果的重要性，不仅是对活力的影响，而且是在更深的层面上:“一旦我们找到了一种可以保存卵泡池的方案，我们需要确保最终的冷冻保护剂浓度不会干扰表观遗传机制，特别是基因组印迹。”

对精度和升级的需求将如何调节这种长期使用的技术，以及对其影响的进一步理解将带来什么，这将是很有趣的。

教授 essor 迈克尔胡椒 而且 教授 essor Christiani阿莫林 我们采访了技术网络博士玛雅·切尔戈娃。188金宝搏备用 Michael Pepper教授是细胞治疗领域的专家，也是南非比勒陀利亚大学细胞和分子医学研究所所长。 教授 essor Christiani Amorim是 比利时鲁汶天主教大学实验和临床研究所。她在卵巢和卵泡冷冻保存和移植方法的开发方面拥有丰富的经验。

参考文献

1. 伍兹，E. J.，瑟鲁马拉，S.，巴德-布坎南，S. S.，克拉克，D. &马修，A. J.。(2016)。现成的细胞疗法:在临床使用的人类细胞冷冻保存和储存过程中要考虑的因素。Cytotherapy18, 697 - 711．
2. Bakhach, J。(2009)。复合组织的冷冻保存:不同类型组织的冷冻保存原理及最新进展。器官发生5, 119 - 126．
3. 杜兰德，C.，德塞尔，C.，达席尔瓦，C.，默多克，C. &佩珀，M. S。(2019)。早期体外扩增和低温保存对脂肪源性基质/干细胞成脂分化能力的影响。科学。代表。9, 1-13．
4. 莱昂内尔，e.c.r。et al。(2019)。阶梯玻璃化技术用于卵巢组织冷冻保存。科学。代表。9, 1 - 12．
5. 畜栏,。等．(2018)。采用分级玻璃化和监测技术保存卵巢组织d通过x射线计算机断层扫描。低温生物学，81, 17-26．